羅 云，趙子明

(徐州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 徐州 221004)

金納米棒(gold nanorods，GNRs)由于形貌及尺寸可控、溫和的表面化學(xué)性質(zhì)、獨(dú)特的表面等離子共振效應(yīng)等特性，廣泛應(yīng)用于生物成像、生物傳感、納米材料組裝、載藥等領(lǐng)域[1-4]。通過(guò)靜電吸附或巰基共價(jià)耦合，GNRs易被葉酸、單抗等修飾，獲得腫瘤靶向性，使其在腫瘤診斷、治療等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[5-8]。

光動(dòng)力治療是較新的抗腫瘤手段，利用激光激活腫瘤組織內(nèi)的光敏劑，產(chǎn)生活性氧類破壞細(xì)胞核與細(xì)胞器，從而殺傷腫瘤[9]。研究發(fā)現(xiàn)，GNRs在激光照射下能產(chǎn)生單線態(tài)氧，且與傳統(tǒng)光敏劑相比，GNRs對(duì)酶與光化學(xué)降解更耐受[10]。另外，GNRs的表面等離子共振效應(yīng)波段位于近紅外光區(qū)(800～1 200 nm)，近紅外光在機(jī)體組織透過(guò)率最高，對(duì)人體損害最小。

十六甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide，CTAB)是制備GNRs常用的穩(wěn)定劑，但由于毒性大，限制了該類GNRs的應(yīng)用[11]。采用聚合物修飾GNRs可以提高其生物相容性。Liao和Hafner[12]制備了巰基化聚乙二醇修飾的GNRs，并利用抗體產(chǎn)生靶向性。Durr等[13]用聚磺苯乙烯鈉和抗表皮生長(zhǎng)因子受體單抗修飾CTAB穩(wěn)定的GNRs，制備特異性識(shí)別并標(biāo)記癌細(xì)胞的探針。Wei等[14]在GNRs表面修飾溫敏聚合物N-異丙基丙烯酰胺，并裝載鹽酸去甲萬(wàn)古霉素與無(wú)機(jī)銀離子。

本研究采用對(duì)腫瘤微酸性pH敏感的聚乙二醇與1-(2-氨乙基)哌啶共接枝透明質(zhì)酸共聚物(polyethylene glycol and 2-piperidinoethylamine co-grafted hyaluronic acid，PPHA)在CTAB穩(wěn)定的GNRs表面形成包衣，以提高其對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性，降低毒副作用，使其在抗腫瘤領(lǐng)域發(fā)揮更好的作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 透明質(zhì)酸鈉(分子量：10 000，山東華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：1706086)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(上海麥克林生化科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：C10115871)，N-羥基琥珀酰亞胺(上海麥克林生化科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：M08418025)，1-(2-氨乙基)哌啶(上海阿拉丁試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：B1925047)，單甲氧基聚乙二醇胺(分子量：5 000，廣州碳水科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：M838268)，四水合氯金酸(HAuCl4·4H2O，上海展云化工有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：170912)，CTAB(大連美侖生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)J1201A)，改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)培養(yǎng)基(江蘇凱基生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào):AAJ207783)，胎牛血清(美國(guó)Thermo Fisher Scientific，批號(hào)：42F0863K)，實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。

激光納米粒度/電位儀(Nicomp 380ZLS,美國(guó)PSS公司)，磁力加熱攪拌器(RCT basic，德國(guó)IKA公司)，紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-3100PC，上海美普達(dá)儀器公司)，透射電子顯微鏡(Tecnai G2 Spirit Twin，美國(guó)FEI公司)，高速離心機(jī)(H1850，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

細(xì)胞：小鼠成纖維細(xì)胞(L929，中科院上海細(xì)胞庫(kù))，人宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞，中科院上海細(xì)胞庫(kù))。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1PPHA修飾的GNRs的制備 透明質(zhì)酸鈉(78 mg)溶解于10 mL 2-(N-嗎啉)乙磺酸緩沖液(pH 5.5), 加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(192 mg)和N-羥基琥珀酰亞胺(115 mg)；室溫?cái)嚢璺磻?yīng)0.5 h后,加入1-(2-氨乙基)哌啶(10 mg)，調(diào)節(jié)pH 8.0，攪拌反應(yīng)2 h；再加入單甲氧基聚乙二醇胺5K (100 mg)繼續(xù)攪拌反應(yīng)12 h。裝入透析袋(截留分子量為8 000)，透析凍干得PPHA。

參照Ye等[15]的方法制備CTAB保護(hù)的GNRs：CTAB(137 mg)溶于4 mL水，加入0.05 mL氯金酸溶液(25 mmol/L)，冰浴下加入0.3 mL的硼氫化鈉溶液(10 mmol/L)，30 ℃放置4 h制成種子溶液。CTAB(1.558 g)溶于42 mL雙蒸水，加入0.72 mL氯金酸溶液(25 mmol/L)和0.27 mL硝酸銀溶液(10 mmol/L)；再加入0.28 mL抗壞血酸溶液(0.1 mol/L)，攪拌20 s后溶液變成無(wú)色，加入0.2 mL種子溶液攪拌60 s，30 ℃靜置過(guò)夜。15 000×g離心15 min，棄上清，用水重懸后再次離心去上清，如此重復(fù)3次，得GNRs懸液。

將GNRs懸液用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4，0.05 mol/L)稀釋為5 mg/mL，按照不同的質(zhì)量比(0.2∶1，0.6∶1，1∶1，2∶1)加入PPHA溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h；15 000×g離心15 min，棄上清，再用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)重懸后得PPHA-GNRs混懸液。

1.2.2PPHA修飾的GNRs的表征 PPHA凍干粉溶于氘代二甲基亞砜/氘水混合溶劑(1∶1，體積比)，四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)，用核磁共振儀檢測(cè)其核磁共振氫譜。

采用納米粒度及zeta電位測(cè)定儀(Nicomp 380/ZLS)測(cè)定PPHA溶液不同pH下的zeta電位，作圖計(jì)算其等電點(diǎn)[16]。將GNRs與PPHA-GNRs配制成2 mg/mL的溶液，納米粒度與zeta電位測(cè)定儀測(cè)定其粒徑與電位。將GNRs與PPHA-GNRs滴于銅網(wǎng)上自然晾干后，透射電鏡觀察其形態(tài)。采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)GNRs與PPHA-GNRs的吸收光譜進(jìn)行掃描(500～800 nm)。

1.2.3PPHA-GNRs的pH敏感性 取PPHA-GNRs混懸液，分別用3種磷酸鹽緩沖液(pH 6.5，7.0，7.4)稀釋至2 mg/mL，納米粒度與zeta電位測(cè)定儀測(cè)定其粒徑與電位。

1.2.4PPHA-GNRs的體外腫瘤靶向性 取10 mL的GNRs混懸液(5 mg/mL)用稀鹽酸調(diào)節(jié)至pH 3，加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)修飾的巰基化聚乙二醇(10 mg)，室溫避光攪拌30 min，15 000×g離心15 min，棄上清，再用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)重懸后得FITC標(biāo)記的GNRs(FITC-GNRs)。將FITC標(biāo)記的GNRs與適當(dāng)比例的PPHA混合，室溫避光攪拌反應(yīng)2 h；15 000×g離心15 min，棄上清，再用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)重懸后得FITC標(biāo)記的PPHA-GNRs(FITC-PPHA-GNRs)混懸液。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞置于24孔板培養(yǎng)12 h。棄掉原有培養(yǎng)基，分別更換為pH 6.5的DMEM培養(yǎng)基[采用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH]、pH 7.4的DMEM培養(yǎng)基，然后加入200 μg/mL的FITC-GNRs或FITC-PPHA-GNRs混懸液，放回培養(yǎng)箱共孵育4 h。冷磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)洗滌細(xì)胞2次，加入RIPA(Radio Immunoprecipitation Assay)裂解液裂解細(xì)胞20 min；取細(xì)胞裂解液用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)GNRs的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)450 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm，狹縫寬度5 nm)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞與HeLa細(xì)胞置于96孔板培養(yǎng)12 h，棄掉原有培養(yǎng)基，分別更換為pH 7.4的DMEM培養(yǎng)基與pH 6.5的DMEM培養(yǎng)基；然后向每孔中加入200 μg/mL的PPHA-GNRs混懸液，放回培養(yǎng)箱共孵育。4 h后，向部分細(xì)胞施加1 200 mW/cm2,2 min的近紅外激光(808 nm)照射，照射后繼續(xù)培養(yǎng)20 h。之后加入細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8，共孵育1 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力。

2 結(jié) 果

2.1PPHA的表征 PPHA的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。透明質(zhì)酸的特征峰(N-乙酰葡萄糖胺的甲基)出現(xiàn)在1.8 ppm處(a)，1-(2-氨乙基)哌啶基團(tuán)的特征氫峰出現(xiàn)在2.2 ppm處(b)，聚乙二醇醚鍵特征峰在3.5 ppm附近(c)，見(jiàn)圖2。PPHA的等電點(diǎn)在pH 6.8附近，當(dāng)pH<6.8時(shí)，其電荷發(fā)生由負(fù)轉(zhuǎn)正的突變，見(jiàn)圖3。

PPHA：聚乙二醇與1-(2-氨乙基)哌啶共接枝透明質(zhì)酸共聚物

PPHA：聚乙二醇與1-(2-氨乙基)哌啶共接枝透明質(zhì)酸共聚物

PPHA：聚乙二醇與1-(2-氨乙基)哌啶共接枝透明質(zhì)酸共聚物

2.2PPHA修飾的GNRs的表征 如圖4所示，GNRs為邊緣光滑整齊的棒狀結(jié)構(gòu)，而PPHA-GNRs表面形態(tài)不規(guī)則，這是由于PPHA大分子包衣造成的。隨著PPHA/GNRs質(zhì)量比的增加，GNRs的尺寸逐漸增大，zeta電位由正值逐漸減少；當(dāng)PPHA/GNRs質(zhì)量比為1∶1時(shí)，尺寸增大明顯，zeta電位已由正值轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)值，表明PPHA能夠吸附在GNRs表面，并將其原本的正電荷完全掩蓋變?yōu)樨?fù)電荷。見(jiàn)表1。GNRs在500 nm左右有小吸收峰，在780 nm左右有最大吸收峰，PPHA修飾后GNRs的吸收峰未發(fā)生明顯偏移，見(jiàn)圖5。

GNRs：金納米棒；PPHA：聚乙二醇與1-(2-氨乙基)哌啶共接枝透明質(zhì)酸共聚物

圖4 GNRs(4a)與PPHA-GNRs(4b)的透射電鏡圖

2.3PPHA-GNRs的pH敏感性 PPHA-GNRs具有顯著的pH敏感性：生理pH下，PPHA在GNRs表面形成包衣，電荷為負(fù)值；腫瘤微酸性pH下，PPHA因?yàn)殡姾煞D(zhuǎn)(由負(fù)電變正電)，與GNRs自身的正電荷相排斥，從GNRs表面脫落，因此PPHA-GNRs的粒徑在pH 6.5時(shí)變小，且zeta電位又恢復(fù)為正值。見(jiàn)表2。

表1 不同質(zhì)量比的PPHA-GNRs的粒徑及電勢(shì)比較

GNRs：金納米棒；PPHA：聚乙二醇與1-(2-氨乙基)哌啶共接枝透明質(zhì)酸共聚物

GNRs：金納米棒；PPHA：聚乙二醇與1-(2-氨乙基)哌啶共接枝透明質(zhì)酸共聚物

圖5 GNRs與PPHA-GNRs的紫外可見(jiàn)吸收?qǐng)D譜

表2不同pH條件下PPHA-GNRs的粒徑及電勢(shì)比較

pH值粒徑(nm)zeta電位(mV)645.6±5.813.1±2.76.549.3±4.36.4±1.27.056.4±5.2-8.5±1.17.457.3±6.8-9.3±0.7

GNRs：金納米棒；PPHA：聚乙二醇與1-(2-氨乙基)哌啶共接枝透明質(zhì)酸共聚物

2.4PPHA-GNRs的體外腫瘤靶向性 FITC標(biāo)記的GNRs與PPHA-GNRs在腫瘤微酸性pH和生理pH下被HeLa細(xì)胞攝取的情況，F(xiàn)ITC-GNRs在pH 6.5和pH 7.4時(shí)的細(xì)胞攝取量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而FITC-PPHA-GNRs在pH 6.5時(shí)的攝取量是pH 7.4時(shí)的3.5倍(P<0.05)，見(jiàn)圖6。GNRs在無(wú)激光照射條件下對(duì)L929細(xì)胞和HeLa細(xì)胞均有一定的殺傷作用；GNRs在激光照射條件下，對(duì)這兩種細(xì)胞的毒性均進(jìn)一步增大。PPHA-GNRs在無(wú)激光照射條件下對(duì)L929細(xì)胞無(wú)明顯毒性，而可以造成HeLa細(xì)胞30%的殺傷；PPHA-GNRs在激光照射條件下對(duì)L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性相比于GNRs有顯著下降(P<0.01)；與自身無(wú)激光照射組相比，PPHA-GNRs激光照射組對(duì)HeLa細(xì)胞的殺傷作用顯著增強(qiáng)(P<0.01)。見(jiàn)圖7。

GNRs：金納米棒；PPHA：聚乙二醇與1-(2-氨乙基)哌啶共接枝透明質(zhì)酸共聚物；**與PPHA-GNRs在pH 6.5的攝取量比較，P<0.01

圖6不同pH條件下HeLa細(xì)胞對(duì)GNRs和PPHA-GNRs的攝取情況

3 討 論

腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境常呈酸性[17]，鑒于此本研究設(shè)計(jì)具有pH敏感性的載藥材料，以期解決化療藥物溶解性差、生物利用度低、毒副作用大等缺點(diǎn)。與普通聚合物膠束相比，pH敏感的聚合物膠束到達(dá)腫瘤細(xì)胞后，在腫瘤細(xì)胞偏酸的微環(huán)境中被觸發(fā)，快速釋放藥物，實(shí)現(xiàn)藥物的可控釋放[18]。張保磊[19]合成了一種聚合物膠束來(lái)包裹光敏劑和化療藥物，依據(jù)增強(qiáng)滲透和滯留效應(yīng)將兩種藥物靶向輸送至黑色素瘤，并由于pH敏感性可較快釋放藥物到達(dá)腫瘤組織。鄧亞君[20]合成了一種pH敏感性雙親嵌段共聚物載藥納米膠束，結(jié)果證明合成的材料能夠?qū)崿F(xiàn)pH靶向釋放效應(yīng)。

7A：L929細(xì)胞；7B：HeLa細(xì)胞；GNRs：金納米棒；PPHA：聚乙二醇與1-(2-氨乙基)哌啶共接枝透明質(zhì)酸共聚物；**與GNRs 激光照射組比較,P<0.01；##與PPHA-GNRs無(wú)激光照射組比較，P<0.01

圖7 GNRs與PPHA-GNRs的殺傷作用

通過(guò)聚乙二醇化修飾，納米藥物表面水溶性增加，且可以有效防止免疫系統(tǒng)的追蹤，延長(zhǎng)了納米藥物的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，因而近年來(lái)成為抗腫瘤藥物改造的研究熱點(diǎn)[21]。Fiorentini等[22]發(fā)現(xiàn)聚乙二醇微球包覆治療不可切除的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移對(duì)腫瘤反應(yīng)有效，具有輕微的毒性和良好的質(zhì)量。多篇文獻(xiàn)報(bào)道了關(guān)于聚乙二醇作為載體表面修飾材料的應(yīng)用，他們?cè)谘芯恐泻铣闪酥|(zhì)體、雙嵌段接枝共聚物、納米膠束等新型藥物給藥系統(tǒng)，結(jié)果提示，經(jīng)聚乙二醇修飾的載藥體系具有不良反應(yīng)小、體內(nèi)循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[23-26]。因此，聚乙二醇作為一種親水高分子材料在抗腫瘤治療、基因治療中具有良好的應(yīng)用前景。

在生理pH下，PPHA包覆在陽(yáng)離子GNRs表面并使其表面電荷轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)值，減弱了其與細(xì)胞膜的親和力，同時(shí)PPHA中的聚乙二醇鏈具有較強(qiáng)的親水性，阻礙了GNRs與細(xì)胞膜的相互作用。在腫瘤弱酸性pH下，PPHA可從GNRs表面脫落，內(nèi)部的陽(yáng)離子GNRs重新暴露，恢復(fù)了其較強(qiáng)的進(jìn)胞能力。本研究細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，對(duì)空白對(duì)照組施加同樣強(qiáng)度的近紅外激光照射不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯殺傷作用，表明單純近紅外激光照射對(duì)實(shí)驗(yàn)無(wú)干擾。GNRs表面的CTAB陽(yáng)離子表面活性劑具有細(xì)胞毒性, 因此即使無(wú)激光照射時(shí)GNRs對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞也均有一定的殺傷作用；GNRs在激光照射條件下，對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的毒性均進(jìn)一步增大，主要是由于激光照射產(chǎn)生的活性氧類造成的。PPHA-GNRs無(wú)論有無(wú)激光照射，對(duì)正常細(xì)胞均無(wú)明顯毒性，說(shuō)明PPHA包衣使GNRs很少被正常細(xì)胞攝取，避免了產(chǎn)生后續(xù)的細(xì)胞毒性。同時(shí)，PPHA-GNRs在腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的弱酸性pH條件下脫去PPHA包衣，可以造成腫瘤細(xì)胞30%的殺傷；在激光照射條件下對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用進(jìn)一步增強(qiáng)，表明脫去包衣的GNRs被HeLa細(xì)胞攝取的量較多，經(jīng)過(guò)紅外激光照射后產(chǎn)生足夠的活性氧類，對(duì)細(xì)胞造成二次殺傷。

綜上所述，本研究成功制備了對(duì)腫瘤微環(huán)境pH敏感的PPHA聚合物，并將之與陽(yáng)離子GNRs結(jié)合，形成pH敏感的PPHA包衣的GNRs。與陽(yáng)離子GNRs相比，PPHA-GNRs對(duì)正常細(xì)胞的殺傷顯著降低，對(duì)腫瘤細(xì)胞在近紅外激光的照射下則保持較強(qiáng)的殺傷作用，具有良好的腫瘤靶向性和臨床應(yīng)用前景。