朱俊亞，李 芳,2,*，趙蘭馨，李席席，劉云宏,2

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471023）

氨芐青霉素（ampicillin，AMP），又稱氨芐莫林，是一種β-內(nèi)酰胺類抗生素，因其耐酸耐霉、殺菌活性強(qiáng)、毒性低及廣譜廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于奶牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中[1]。經(jīng)常食用AMP殘留奶制品會(huì)增強(qiáng)機(jī)體耐藥性，造成肝腎功能損害，嚴(yán)重的還會(huì)影響機(jī)體耐藥基因的傳遞和患病醫(yī)學(xué)治療[2-3]。為保障人體健康，許多國家和地區(qū)都對(duì)AMP在牛奶中的最大殘留量進(jìn)行了規(guī)定：歐盟標(biāo)準(zhǔn)為4 μg/kg（約1.0×10-8mol/L）[4]，美國標(biāo)準(zhǔn)為10 μg/kg（約2.5×10-8mol/L）[5]，我國農(nóng)業(yè)部最新修訂頒布的《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》標(biāo)準(zhǔn)為10 μg/kg（約2.5×10-8mol/L）。國內(nèi)外對(duì)牛奶中AMP最大殘留量的強(qiáng)制規(guī)定推動(dòng)了AMP檢測(cè)方法的發(fā)展與創(chuàng)新。目前，常用的AMP檢測(cè)方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、液相-質(zhì)譜聯(lián)用法等[6]，這些方法存在過程繁瑣、儀器昂貴和操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。近年來，免疫分析（immunoassay，IAs）法應(yīng)用日趨廣泛，但由于AMP是小分子化合物，存在抗體質(zhì)量不穩(wěn)定、方法特異性差等問題，限制了IAs法的普及[7]。適配體克服了傳統(tǒng)抗體的缺點(diǎn)，具有篩選周期短、合成批次間差異小、親和性和特異性高等特點(diǎn)[8-9]，為小分子化合物檢測(cè)提供了一種可替代的識(shí)別元件。以適配體作為識(shí)別元件的傳感檢測(cè)技術(shù)開始嶄露頭角[10]。曾憲冬等[11]利用核酸適配體-金納米顆粒比色傳感技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)赭曲霉毒素A的快速、高效檢測(cè)。Ma Qiang等[12]利用金納米顆粒和單鏈DNA構(gòu)建比色適配體傳感器，實(shí)現(xiàn)了牛奶和雞蛋中妥布霉素的有效檢測(cè)。已報(bào)道的適配體傳感檢測(cè)技術(shù)多采用金納米顯色技術(shù)[13-15]、熒光光譜分析[16-18]，對(duì)于將納米磁磁與電化學(xué)技術(shù)相結(jié)合運(yùn)用于食品中AMP檢測(cè)的報(bào)道甚少，仍有待深入研究。

本研究以AMP為研究對(duì)象，選擇納米磁磁為載體，將兩者共價(jià)偶聯(lián)。在AMP-適配體特異性結(jié)合基礎(chǔ)上，以偶聯(lián)的AMP為識(shí)別探針，與待測(cè)樣中的AMP共同競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系中的適配體和辣根過氧化物酶，并利用磁性玻碳電極將上述磁磁吸附于電極檢測(cè)表面直接進(jìn)行電化學(xué)測(cè)定，構(gòu)建可用于牛奶中AMP高效檢測(cè)的電化學(xué)適配體傳感檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羧基納米磁磁 英芮誠生化科技（上海）有限公司；AMP（≥98.89%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；AMP適配體（5’-biotin-GCG GGC GGT TGT ATA GCG G-3’）生工生物工程（上海）股份有限公司；鏈霉親和素修飾的辣根過氧化物酶（streptavidin-horseradish peroxidase，SA-HRP） 北京博奧森生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)操作過程中所用溶液均為超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm）配制。

1.2 儀器與設(shè)備

TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；KQ2200型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；BE-1100型四維旋轉(zhuǎn)混合儀 海門市其林貝爾儀器有限公司；CHI620E型電化學(xué)工作站 上海辰華儀器有限公司；HRCLJ-02型磁性分離架 河南惠爾納米科技有限公司。

電化學(xué)檢測(cè)使用三電極體系：磁性玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，購自武漢高仕睿聯(lián)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)原理

基于電化學(xué)適配體傳感器檢測(cè)牛奶中AMP的原理如圖1所示。采用碳二亞胺交聯(lián)法制備了修飾有AMP的磁磁（磁性識(shí)別探針），其可與適配體特異性結(jié)合構(gòu)成磁性AMP-適配體復(fù)合物，由于所合成適配體的5’端修飾有生物素，因此當(dāng)加入SA-HRP后，在鏈霉親和素-生物素作用下，又可將HRP偶聯(lián)到磁磁表面，隨后便可利用磁性玻碳電極，將上述磁磁（磁性信號(hào)探針）磁吸固定于電極的檢測(cè)表面[19]，在HQ、H2O2條件下進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。該檢測(cè)體系是以AMP-適配體競(jìng)爭(zhēng)模式為基礎(chǔ)進(jìn)行的，當(dāng)檢測(cè)體系中存在游離的（待測(cè)）AMP時(shí)，會(huì)和磁磁表面修飾的AMP競(jìng)爭(zhēng)與適配體結(jié)合的機(jī)會(huì)，形成較多的游離（待測(cè)）AMP-適配體復(fù)合物，導(dǎo)致磁性AMP-適配體復(fù)合物數(shù)量的減少，使得能夠結(jié)合到磁磁表面的HRP數(shù)量也隨之減少，故獲得較低的電化學(xué)檢測(cè)信號(hào)。相反，當(dāng)檢測(cè)環(huán)境中不存在游離的（待測(cè)）AMP時(shí)，則不存在上述競(jìng)爭(zhēng)過程，因而可獲得較高的電化學(xué)檢測(cè)信號(hào)。該適配體傳感器通過競(jìng)爭(zhēng)前后顯著的電化學(xué)信號(hào)變化實(shí)現(xiàn)對(duì)牛奶中AMP的有效檢測(cè)。

圖1 適配體傳感器檢測(cè)AMP原理圖Fig. 1 Schematic illustration of the electrochemical aptasensor for the detection of ampicillin based on competitive format

1.3.2 適配體傳感器的構(gòu)建

1.3.2.1 磁性AMP識(shí)別探針的制備

主要步驟參照文獻(xiàn)[20]，采用碳二亞胺交聯(lián)法制備磁性AMP識(shí)別探針。于1 mg羧基納米磁磁中加入1 mL 15 mmol/L 2-(N-嗎啉)乙磺酸（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MES）偶聯(lián)液洗滌2 次。加入100 μL 15 mmol/L MES偶聯(lián)液和100 μL EDC溶液重懸磁磁，室溫條件下于四維旋轉(zhuǎn)混合儀上避光活化。磁分離，用1 mL 15 mmol/L MES偶聯(lián)液洗滌2 次。加入500 μL AMP溶液，室溫條件下于四維旋轉(zhuǎn)混合儀上避光孵育。產(chǎn)物用PBST（0.01 mol/L PBS，0.05% Tween-20，pH 7.4）洗滌2 次，再加入1 mL PBS重懸，4 ℃貯存。

1.3.2.2 磁性AMP-適配體復(fù)合物的制備

磁分離去上清液，加入適量待測(cè)AMP和適配體溶液，混合均勻，室溫條件下于四維旋轉(zhuǎn)混合儀上避光孵育一段時(shí)間。產(chǎn)物用PBST洗滌3 次。

1.3.2.3 磁性信號(hào)探針的制備

方上述復(fù)合物中加入200 μL SA-HRP稀釋液（1∶1 000），室溫條件下于四維旋轉(zhuǎn)混合儀上避光孵育一段時(shí)間。產(chǎn)物用PBST洗滌3 次，再加入200 μL PBS重懸，4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.4 適配體傳感器的組裝

利用磁性玻碳電極具有的磁性吸附作用，將上述磁磁（磁性AMP信號(hào)探針）磁吸固定于磁性工作電極檢測(cè)表面，用于后續(xù)電化學(xué)檢測(cè)。

1.3.3 工作電極的預(yù)處理

工作電極選擇磁性玻碳電極，依次用0.3、0.05 μm的拋光粉（Al2O3）打磨拋光至鏡面，隨后依次用超純水、體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液、超純水超聲清洗。最后置于0.5 mol/L H2SO4溶液中用循環(huán)伏發(fā)法活化，直至得到穩(wěn)定的循環(huán)伏發(fā)曲線為止，處理后的電極用氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

1.3.4 電化學(xué)檢測(cè)

適配體傳感器的電化學(xué)表征通過循環(huán)伏發(fā)法在含1 mmol/L K3[Fe(CN)6]和1 mmol/L K4[Fe(CN)6]的0.1 mol/L KCl溶液中測(cè)定。循環(huán)伏發(fā)法檢測(cè)參數(shù)如下：初始電位-0.1 V、終止電位0.6 V、掃描速率0.05 V/s、掃描圈數(shù)2、取樣間隔0.001 V、靜置時(shí)間2 s。

氧化電流通過線性掃描伏發(fā)法在含HQ、H2O2的PBS中測(cè)定。檢測(cè)參數(shù)如下：初始電位0.1 V、終止電位-0.3 V、掃描速率0.1 V/s、取樣間隔0.001 V、靜置時(shí)間2 s。

1.3.5 特異性實(shí)驗(yàn)

參照實(shí)驗(yàn)步驟1.3.2節(jié)，分別加入1.0×10-8mol/L AMP和1.0×10-6mol/L的阿莫莫林、四環(huán)素、卡那霉素、紅霉素進(jìn)行特異性檢驗(yàn)，檢測(cè)條件同1.3.4節(jié)氧化電流檢測(cè)方法所述。

1.3.6 實(shí)際樣品處理

為驗(yàn)證本適配體傳感器的實(shí)用性，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法來檢測(cè)牛奶中的AMP。參照文獻(xiàn)[21]對(duì)市售牛奶進(jìn)行預(yù)處理，首先以牛奶為本底配制一定濃度梯度的AMP牛奶樣品，接著加入20%三氯乙酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.6，于45 ℃條件下沉淀15 min，然后在10 000 r/min離心25 min，最后將得到的上清液用0.22 μm濾膜過濾備用。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采集于CHI620E型電化學(xué)工作站，以各優(yōu)化條件對(duì)AMP-適配體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)發(fā)生前后適配體傳感器凈電流值ΔI的變化量為依據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，公式如下：

ΔI＝I0-IX

式中：I0為適配體傳感器在反應(yīng)體系中不存在待測(cè)AMP參與競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)所測(cè)電流值；IX為適配體傳感器在反應(yīng)體系中存在待測(cè)AMP參與競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)所測(cè)電流值。

2 結(jié)果與分析

2.1 電極修飾表征

采用循環(huán)伏發(fā)法表征磁性AMP信號(hào)探針在電極表面的修飾。圖2為不同電極在0.1 mol/L KCl+1 mmol/L溶液中的循環(huán)伏發(fā)曲線。如圖2所示，曲線a為裸磁性玻碳電極的CV曲線，呈現(xiàn)明顯的氧化還原特征，表現(xiàn)出可逆的氧化還原行為。曲線b為修飾了磁性AMP信號(hào)探針后的電極循環(huán)伏發(fā)曲線，在磁性作用下，所構(gòu)成的磁性AMP信號(hào)探針被修飾到磁性玻碳電極的檢測(cè)表面，形成一層不導(dǎo)電的絕緣核酸、蛋白層，阻礙了電子的傳輸，從而導(dǎo)致氧化還原電流值降低。此現(xiàn)象表明磁性AMP信號(hào)探針已成功固定到電極的表面上。

圖2 磁性玻碳電極修飾磁性AMP信號(hào)探針前后電化學(xué)表征Fig. 2 Electrochemical signal of magnetic glass carbon electrode before and after capturing magnetic AMP signal probe

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化

為提高適配體傳感器的性能，同時(shí)達(dá)到節(jié)約成本、節(jié)省時(shí)間的目的，對(duì)磁性AMP-適配體復(fù)合物形成過程中的反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)pH值、檢測(cè)過程中磁性信號(hào)探針的使用量、測(cè)試過程中底液H2O2及HQ濃度等進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.1 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

為保證反應(yīng)體系中的AMP充分競(jìng)爭(zhēng)獲得AMP適配體形成相應(yīng)狀態(tài)的AMP-適配體復(fù)合物，對(duì)反應(yīng)時(shí)間為10、20、30、40、50 min和60 min的樣品進(jìn)行電化學(xué)分析，由圖3可知，反應(yīng)進(jìn)行前30 min，凈電流值隨時(shí)間延長(zhǎng)快速增加，于第30分鐘處達(dá)到最大值，反應(yīng)進(jìn)行30 min后，凈電流值隨時(shí)間延長(zhǎng)開始呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)。這表明反應(yīng)進(jìn)行第30分鐘時(shí)，游離的（待測(cè)）AMP可充分競(jìng)爭(zhēng)獲得反應(yīng)體系中的適配體，形成較多的游離（待測(cè)）AMP-適配體復(fù)合物，那么磁性AMP-適配體復(fù)合物的數(shù)量就會(huì)同步減少，影響磁性AMP信號(hào)探針形成量，從而獲得較高的凈電流值。因此，選定最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間為30 min。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)凈電流的影響Fig. 3 Effect of reaction time on ΔI

2.2.2 反應(yīng)pH值的優(yōu)化

圖4 反應(yīng)pH值對(duì)凈電流的影響Fig. 4 Effect of pH value on ΔI

測(cè)定不同pH值條件下樣品的電化學(xué)信號(hào)，由圖4可知，隨著pH值的升高，適配體傳感器檢測(cè)的凈電流值也在增加，在pH 8.0時(shí)凈電流值最大。繼續(xù)升高pH值時(shí)，凈電流值反而急速下降。這表明pH值對(duì)不同狀態(tài)AMP-適配體復(fù)合物的形成影響較大，當(dāng)pH 8.0時(shí)，適配體結(jié)構(gòu)中的活性結(jié)合位點(diǎn)增加[22]，有助于游離（待測(cè)）AMP-適配體復(fù)合物形成，產(chǎn)生較高的凈電流值。而pH值過大或者過小都會(huì)影響適配體結(jié)構(gòu)中結(jié)合位點(diǎn)的活性，導(dǎo)致游離（待測(cè)）AMP-適配體復(fù)合物數(shù)量的減少，產(chǎn)生較低的凈電流值。因此，選定AMP-適配體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的最優(yōu)pH值為8.0。

2.2.3 磁性信號(hào)探針使用量的優(yōu)化

電化學(xué)檢測(cè)過程中，適量磁性信號(hào)探針的使用可以提高適配體傳感器的靈敏度，同時(shí)還能保證其不造成浪費(fèi)。因此，需要對(duì)檢測(cè)過程中磁性信號(hào)探針的使用量進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)中依次將10、30、50、100 μg和150 μg磁性信號(hào)探針磁吸固定于處理過的工作電極檢測(cè)表面，通過電化學(xué)工作站對(duì)凈電流值進(jìn)行檢測(cè)分析。由圖5可知，隨著磁性信號(hào)探針使用量的增加，凈電流值快速增大，在50 μg處達(dá)到最大值。當(dāng)繼續(xù)增加磁性信號(hào)探針使用量時(shí)，凈電流值反而呈現(xiàn)逐步下降趨勢(shì)。這表明隨著磁性信號(hào)探針使用量的增加，磁性電極表面的有效吸附區(qū)域正被逐步覆蓋，在50 μg使用量時(shí)達(dá)到飽和，之后繼續(xù)增加磁性信號(hào)使用量反而使探針相互堆積，電子傳輸速率受到影響，導(dǎo)致凈電流值減弱。因此，磁性信號(hào)探針的最優(yōu)使用量為50 μg。

圖5 磁性信號(hào)探針使用量對(duì)凈電流的影響Fig. 5 Effect of the amount of magnetic signal probe on ΔI

2.2.4 檢測(cè)條件的優(yōu)化

圖6 檢測(cè)體系中H2O2濃度對(duì)凈電流的影響Fig. 6 Effect of H2O2 concentration on ΔI

圖7 檢測(cè)體系中HQ濃度對(duì)凈電流的影響Fig. 7 Effect of HQ concentration on ΔI

檢測(cè)H2O2濃度對(duì)凈電流值的影響，如圖6所示，H2O2濃度在0.5 mmol/L時(shí)，凈電流值達(dá)到最大值，所以H2O2最優(yōu)濃度為0.5 mmol/L。同時(shí)，以相同的實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)HQ濃度對(duì)凈電流值的影響。如圖7所示，HQ濃度在0.5 mmol/L時(shí)，凈電流值最大，其余濃度條件下的凈電流值雖有變化，但都遠(yuǎn)小于0.5 mmol/L時(shí)的凈電流值。因此，HQ最優(yōu)濃度為0.5 mmol/L。

2.3 AMP的定量檢測(cè)結(jié)果

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，采用本傳感檢測(cè)方法對(duì)不同AMP濃度梯度為的樣品進(jìn)行測(cè)定。如圖8所示，其氧化電流值隨著待測(cè)樣品中AMP濃度的降低而升高。以樣品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，競(jìng)爭(zhēng)前后的凈電流值為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果顯示該適配體傳感器在AMP含量為1.0×10-12～1.0×10-8mol/L的濃度梯度范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：ΔI/μA=2.239 8+0.171 9 lgCAMP，R2=0.995 4，檢出限為1.0×10-12mol/L。該適配體傳感器檢測(cè)法與文獻(xiàn)報(bào)道的AMP檢測(cè)法相比，有較低的檢測(cè)限和較寬的檢測(cè)范圍（表1）。此外，將制備好的適配體傳感器置于4 ℃條件下避光保存，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，每隔1 d對(duì)濃度為1.0×10-9mol/L的AMP進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，以檢測(cè)該適配體傳感器的穩(wěn)定性。在1.0×10-9mol/L AMP條件下，線性掃描伏發(fā)法測(cè)定結(jié)果的日內(nèi)精密度為1.51%，日間精密度為3.30%。上述結(jié)果表明，放置一段時(shí)間的適配體傳感器檢測(cè)效果與最初制備的適配體傳感器檢測(cè)效果差異不大，具有良好的穩(wěn)定性（7 d）。

圖8 適配體傳感器在不同AMP濃度下的線性掃描伏安法掃描圖Fig. 8 Linear sweep voltammetry analysis of the aptasensor with different AMP concentrations

表1 本實(shí)驗(yàn)適配體傳感器與其他檢測(cè)方法比較Table 1 Comparison of the developed method with other detection methods

2.4 方法特異性

為驗(yàn)證該適配體傳感器的特異性，排除實(shí)際樣品檢測(cè)中可能遇到的其他族類或結(jié)構(gòu)類似抗生素的干擾，分別加入1.0×10-8mol/L AMP，1.0×10-6mol/L的阿莫莫林、四環(huán)素、卡那霉素和紅霉素反應(yīng)進(jìn)行電化學(xué)信號(hào)測(cè)定。如圖9所示，當(dāng)檢測(cè)體系中存在1.0×10-8mol/L的AMP時(shí)，凈電流值明顯最高，但是當(dāng)檢測(cè)體系中的AMP由1.0×10-6mol/L的其他抗生素替代時(shí)，凈電流值都明顯偏低。由此表明，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的適配體傳感器對(duì)AMP具有較高的特異性。

圖9 適配體傳感器特異性分析Fig. 9 Specificity analysis of the aptasensor

2.5 牛奶樣品檢測(cè)結(jié)果

取購自超市的新鮮純牛奶，按照1.3.6節(jié)方法進(jìn)行預(yù)處理后，對(duì)其進(jìn)行加標(biāo)回回實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)回回率為95.24%～101.30%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）不大于4.38%（n=5）。結(jié)果表明：該電化學(xué)適配體傳感檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際牛奶樣品中AMP含量的測(cè)定（表2）。

表2 牛奶樣品中AMP的檢測(cè)結(jié)果Table 2 Recoveries and precision for ampicillin in spiked milk sample

3 結(jié) 論

以羧基納米磁磁為載體，適配體與AMP特異性結(jié)合為基礎(chǔ)，構(gòu)建AMP電化學(xué)適配體傳感器。采用碳二亞胺交聯(lián)法制備了修飾有AMP的磁磁，并以其為磁性識(shí)別探針，與待測(cè)樣中AMP共同競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系中的適配體和辣根過氧化物酶，隨后利用磁性電極將上述磁磁（磁性信號(hào)探針）吸附于電極檢測(cè)表面進(jìn)行電化學(xué)測(cè)定。對(duì)影響適配體傳感器性能的參數(shù)，如競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)pH值、磁性信號(hào)探針使用量、測(cè)試底液中H2O2和HQ濃度等進(jìn)行了優(yōu)化。確定最佳競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間為30 min，反應(yīng)pH值為8.0，磁性信號(hào)探針使用量為50 μg，測(cè)試底液中H2O2和HQ濃度均為0.5 mmol/L。在最佳條件下，該適配體傳感器在AMP濃度為1.0×10-12～1.0×10-8mol/L梯度范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限可達(dá)1.0×10-12mol/L，具有較低的檢測(cè)限和較寬的檢測(cè)范圍。通過加標(biāo)回回實(shí)驗(yàn)檢測(cè)牛奶樣品中的AMP，證明該適配體傳感器可用于牛奶中AMP的高效檢測(cè)。