郭蓮東，徐 麗，歐才智，丁陽月，張高鵬，倪春蕾，程建軍*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

小米（Setaria italica Beauv.），禾本科狗尾草屬植物，是谷子脫殼后的產(chǎn)物，但它并不是一個(gè)單一品種，而是珍磁稷、谷子、黍以及穇子[1]等幾種小粒谷物的總稱。小米的營養(yǎng)價(jià)值與其他谷物相比相當(dāng)或更優(yōu)[2]。與大米和小麥相比，小米含有較高的鈣、膳食纖維和蛋白質(zhì)[3]；與水稻、玉米和高粱等谷物相比，小米的蛋白質(zhì)含量與之相等甚至更高[4]。

存在于谷物種子中的蛋白質(zhì)是在種子發(fā)育階段特異性合成的，且受到營養(yǎng)素的調(diào)節(jié)[5]。傳統(tǒng)上，這些蛋白質(zhì)根據(jù)溶解度的物理性質(zhì)分為清蛋白（水溶性）、球蛋白（鹽溶性）、醇溶蛋白（醇溶性）和谷蛋白（堿溶性）[6]。其中，醇溶蛋白和谷蛋白[7-9]在大多數(shù)谷物中含量較高，受到較多關(guān)注。玉米醇溶蛋白不溶于水，但在醇、高濃度尿素、堿（pH≥11）或陰離子洗滌劑存在下可溶，這是由于非極性氨基酸殘留的比例很高，并且缺乏酸性和堿性氨基酸的緣故[8]。玉米醇溶蛋白可分為α-、β-、γ-、δ-醇溶蛋白[10]，α-醇溶蛋白含量占醇溶蛋白總含量的75%～80%，并且根據(jù)略有不同的分子質(zhì)量（19、22 kDa）分為兩組。麥醇溶蛋白主要是單體蛋白質(zhì)，被分為α-、β-、γ-、ω-麥醇溶蛋白，其分子質(zhì)量為28～55 kDa。麥谷蛋白是一種聚合物，并且可分為高分子質(zhì)量組（70～90 kDa）和低分子質(zhì)量組（20～45 kDa）[11]。麥醇溶蛋白和麥谷蛋白亞基都具有異常高水平的脯氨酸和谷氨酰胺[5]。與小麥、大麥和玉米相比，小米具有較高比例的醇溶蛋白和谷蛋白[12]。其中，小米醇溶蛋白可分為α-、β-、γ-醇溶蛋白[13]，且分子質(zhì)量較?。s25～26 kDa）[12]；而谷蛋白，一般可以分為高分子亞基組和低分子亞基組[11]。除此之外，有研究表明小米中的蛋白質(zhì)可能以聚集體的形式存在[14]。趙學(xué)偉等[15]對4 種小米蛋白組分的提取、溶解性等功能性質(zhì)以及相對分子質(zhì)量做了一定的研究。

目前，谷物蛋白中研究較多的是大豆[16-17]、小麥[7,18]和玉米蛋白[10,19]等，本研究旨在探討小米蛋白組分的結(jié)構(gòu)特性，以期為今后小米產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米（龍谷25） 黑龍江省肇源縣古龍鎮(zhèn)；考馬斯亮藍(lán)G250和R250 上海躍騰生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉、無水乙醇、磷酸 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；甲醇天津市富宇精細(xì)化工有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）制備試劑盒、牛血清白蛋白 北京索萊寶科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷 北京太陽神科技有限公司；甘氨酸 北京生物科技有限公司。所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UVmini-1240紫外-可見分光光度計(jì) 島津儀器（蘇州）有限公司；PHS-3C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；BG-Power 600i SDS-PAGE儀 北京百晶生物技術(shù)有限公司；Alpha 1-2 LDplus冷凍干燥機(jī)德國Christ公司；SU8010掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本Hitachi公司；DSC 3+差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 瑞士梅特勒-托利多公司；ALPHA-T傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）儀 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 小米蛋白組分的制備

將小米粉碎過80 目篩，使用索氏抽提法將小米粉中脂肪除去，使用脫脂后的小米粉進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取。由于傳統(tǒng)上將谷物蛋白根據(jù)溶解度分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白[6]。用Osborne法[20]分離提取出清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。清蛋白和球蛋白分別是水溶性蛋白及鹽溶性蛋白，醇溶蛋白溶于醇溶液，谷蛋白溶于堿性溶液。因此，分別使用蒸餾水、3%氯化鈉溶液、75%乙醇溶液以及氫氧化鈉溶液按照以下流程對脫脂小米粉進(jìn)行蛋白質(zhì)的提?。▓D1）。

圖1 小米蛋白組分提取的工藝流程Fig. 1 Flow chart of the extraction process for millet protein components

1.3.2 小米蛋白組分含量測定

使用凱氏定氮法[21]確定小米中蛋白質(zhì)的含量。

1.3.3 SDS-PAGE分析

參考Laemmli[22]的SDS不連續(xù)電泳法并稍作改進(jìn)。將樣品溶于樣品溶解液中，后于100 ℃煮沸3 min，冷卻后待用。分別配制15%分離膠以及5%濃縮膠，待膠凝固后可開始上樣，依次加入5 μL Marker，以及10 μL樣品，上樣后打開電泳儀將電壓調(diào)至80 V，當(dāng)試樣到濃縮膠底端時(shí)，電壓調(diào)至120 V繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，當(dāng)試樣帶距邊緣1 cm處停止電泳。將膠體取出，浸于染色液中染色后，于脫色液中脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相對遷移率以及相對分子質(zhì)量。

1.3.4 SEM觀察

使用SU8010 SEM觀察小米蛋白組分的微觀形態(tài)。在加速電壓為5 kV的條件下，于5 000～20 000不同放大倍數(shù)下觀察樣品，并使用內(nèi)置軟件捕獲圖像[14]。

1.3.5 DSC分析

使用DSC儀測量熱穩(wěn)定性。將1～3 mg蛋白質(zhì)樣品置于鋁盤內(nèi)，鋁盤用鋁蓋密封，然后以2.0 K/min的速度在0～300 ℃條件下，使用干燥氮?dú)庖?0.0 mL/min恒溫吹掃。使用密封的空鋁盤作為參考。通過STARe軟件從熱分析圖譜中分析變性溫度[23]。

1.3.6 FTIR分析

使用FTIR儀研究小米蛋白組分的二級結(jié)構(gòu)。使用溴化鉀壓片法，將經(jīng)過冷凍干燥的樣品置于機(jī)器上以記錄300～4 000 cm-1范圍內(nèi)的光譜變化，用32 次掃描和4 cm-1分辨率記錄FTIR光譜[24-25]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次作為平行，使用SPSS軟件（Windows 13.0）對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，并使用OriginPro 8.5作圖。P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小米蛋白組分含量

經(jīng)凱氏定氮法測定，小米中總蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.47%，清蛋白占總蛋白含量的4.12%，球蛋白為11.42%，谷蛋白為20.77%，醇溶蛋白為43.02%，與魏益民等[13]研究的結(jié)果相似。

2.2 蛋白組分亞基分析

圖2 小米蛋白組分的SDS-PAGE圖Fig. 2 SDS-PAGE images of the millet protein components

由圖2可知，清蛋白具有多條譜帶，在分子質(zhì)量11～100 kDa的范圍內(nèi)均有存在，并且高低分子質(zhì)量范圍內(nèi)各有1 條較明顯的譜帶，分別為108.17 kDa和23.98 kDa；球蛋白的譜帶主要集中在低分子質(zhì)量范圍內(nèi)（11～25 kDa），主要由22.77 kDa等分子質(zhì)量較小的亞基組成；醇溶蛋白由3 條比較明顯的譜帶，其分子質(zhì)量分別為18.96、11.86、24.94 kDa等小分子亞基組成，這3 條譜帶分別稱為α-醇溶蛋白、β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白[13]；谷蛋白存在多條譜帶，可分為低分子亞基組（11～48 kDa）以及高分子亞基組（48～180 kDa），但無特征譜帶出現(xiàn)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，這4 種蛋白組分有亞基重合現(xiàn)象，如24.94 kDa和16 kDa的亞基在4 種蛋白條帶上均有出現(xiàn)，但條帶深淺不同，可能是蛋白含量不同導(dǎo)致的；分子質(zhì)量為108.17 kDa和63 kDa的亞基在清蛋白和球蛋白上均有出現(xiàn)，說明清蛋白與其他3 種蛋白組分中存在相同的亞基條帶。

2.3 蛋白組分的微觀結(jié)構(gòu)

圖3 小米中4 種蛋白組分的SEM圖Fig. 3 SEM images of four protein components in millet

從圖3a可見，放大5 000 倍可以清晰地看到清蛋白顆粒，但某些顆粒呈現(xiàn)不規(guī)則的球狀，其粒徑范圍約在604～2 500 nm之間，較其他3 種蛋白組分的粒徑偏大；而在圖3b可以看到，球蛋白以簇狀形態(tài)存在，顆粒形狀不規(guī)則，其粒徑范圍約在319～847 nm之間。醇溶蛋白和谷蛋白均以顆粒形式存在，但是其聚集狀態(tài)存在較大差異，醇溶蛋白分子連接緊密，其粒徑范圍約在202～1 310 nm之間，而谷蛋白顆粒之間連接松散，表面光滑，粒徑范圍約在225～686 nm之間（圖3c、d）。Gulati等[14]在黍米粉和提取的蛋白質(zhì)中觀察到球形蛋白體，以簇狀形態(tài)存在，并認(rèn)為這很有可能是提取過程和樣品制備造成的結(jié)果，與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。Liao Lan等[7]使用原子力顯微鏡觀察了小麥面筋蛋白的微觀結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)小麥面筋蛋白是一種由類島狀和條狀聚集體復(fù)合形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。小米蛋白與小麥蛋白相似，均以聚集體的形式存在。

2.4 熱特性分析

圖4 小米中4 種蛋白組分的DSC曲線Fig. 4 DSC curves of four protein components in millet

熱變性是通過共價(jià)和非共價(jià)以及疏水相互作用的分子聚集而誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性[26]。圖4顯示了醇溶蛋白、谷蛋白、清蛋白和球蛋白的DSC熱分析圖譜。這4 種小米蛋白組分的變性溫度分別為110.67、84.80、98.97、71.33 ℃，對應(yīng)的焓變（ΔH）分別為75.61、78.60、52.23、6.37 J/g。而蛋白質(zhì)變性所需的能量反映了將其解離成更簡單的結(jié)構(gòu)以及展開蛋白質(zhì)所需的能量，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定時(shí)，變性溫度就會更高[23]，因此，醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)可能比其他3 種蛋白質(zhì)更穩(wěn)定。蛋白質(zhì)有序構(gòu)象的情況則通過焓變反映出，焓值變化較小表明變性所需要的能量越小[27]，且根據(jù)SEM圖（圖3）可以看到，球蛋白顆粒并不像其他3 種蛋白組分較為密集地聚集在一起，可能是谷蛋白顆粒之間的疏水相互作用更強(qiáng)導(dǎo)致的。因此在達(dá)到變性溫度后，球蛋白更易于變性，而醇溶蛋白、谷蛋白和清蛋白則需要吸回更多的熱量后才發(fā)生變性[28]。

2.5 FTIR分析

圖5 小米中4 種蛋白組分的FTIR圖譜Fig. 5 FTIR spectra of four protein components in millet

圖5 清晰地顯示了小米中醇溶蛋白、谷蛋白、清蛋白和球蛋白的特征紅外吸回峰。存在于1 700～1 200 cm-1之間的吸回峰包含蛋白質(zhì)和多糖的振動區(qū)域[29]。其中酰胺I帶的吸回峰發(fā)生在1 600～1 700 cm-1處，它主要是由C＝O以及較弱的C—N伸縮和N—H彎曲引起的[30]。在圖5中，可以看到醇溶蛋白、谷蛋白、清蛋白和球蛋白在此范圍內(nèi)有1 649、1 645、1 644、1 648 cm-1處的吸回峰；酰胺II帶發(fā)生在1 500～1 600 cm-1處，主要是由于C—N伸展以及N—H彎曲振動產(chǎn)生的，圖中分別處于1 518、1 526、1 530、1 523 cm-1的吸回峰則對應(yīng)酰胺II區(qū)域；以及1 444、1 440、1 425、1 424 cm-1附近的酰胺III帶（C—N吸回峰）。在3 285 cm-1處4 種蛋白樣品出現(xiàn)了強(qiáng)且寬的吸回峰，這主要是O—H鍵伸縮振動吸回，該吸回峰較強(qiáng)所以干擾了出峰位置相近的N—H伸縮振動吸回峰。

而多糖的吸回峰所在的區(qū)域位于900～1 200 cm-1，在此范圍內(nèi)出現(xiàn)了多糖及其糖類異構(gòu)體的吸回，其中1 145 cm-1附近吸回峰歸屬為C—O以及C—C鍵的伸縮振動；1 012 cm-1附近吸回峰歸屬為C—O鍵的伸縮振動以及C—OH的彎曲振動。這可能是由于蛋白組分中存在糖蛋白，這有待于進(jìn)一步探討。

擬合圖譜中各子峰與二級結(jié)構(gòu)對應(yīng)關(guān)系為：1 650～1 660 cm-1附近的吸回峰為α-螺旋，1 610～1 642 cm-1為β-折疊結(jié)構(gòu)，1 660～1 680 cm-1為β-轉(zhuǎn)角，1 680～1 700 cm-1為β-反平行折疊，1 642～1 650 cm-1為無規(guī)卷曲[31]。從表1可以看到，小米蛋白的二級結(jié)構(gòu)中存在α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、β-反平行折疊，但是未發(fā)現(xiàn)無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。除清蛋白外，其他3 種蛋白組分中均以β-折疊結(jié)構(gòu)為主，其次是α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角，β-反平行折疊含量最低，醇溶蛋白的β-轉(zhuǎn)角以及β-反平行折疊結(jié)構(gòu)最豐富，并與其他蛋白結(jié)構(gòu)含量差異顯著（P＜0.05）。本研究結(jié)果與Beck等[32]等通過擠壓豌豆分離蛋白所形成的蛋白質(zhì)聚集物二級結(jié)構(gòu)的組成一致，都是由α-螺旋、β-折疊、非共價(jià)鍵合的β-轉(zhuǎn)角或反平行β-折疊結(jié)構(gòu)形成。

表1 小米蛋白組分的二級結(jié)構(gòu)含量Table 1 Secondary structure contents of millet protein components

3 結(jié) 論

通過SDS-PAGE、SEM、DSC以及FTIR對小米中的4 種蛋白組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。從SDS-PAGE圖像觀察到醇溶蛋白是由低分子質(zhì)量亞基（11～25 kDa）構(gòu)成，有3 條比較明顯范圍的條帶，分別為α-醇溶蛋白、β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白；而清蛋白、球蛋白和谷蛋白亞基分布較廣（11～180 kDa），其中清蛋白所含亞基數(shù)目最多，并且清蛋白與其他3 種蛋白組分中存在相同的亞基條帶，如24.94 kDa和16 kDa的亞基在4 種蛋白條帶上均有出現(xiàn)。

SEM圖與DSC圖譜顯示，球蛋白顆粒并不像其他3 種蛋白組分較為密集地聚集在一起，且焓值變化較其他3 種蛋白組分更小，因此在達(dá)到變性溫度后，球蛋白更易于變性。而醇溶蛋白的變性溫度最高，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)較其他3 種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。

FTIR圖譜顯示，4 種蛋白組分處于酰胺I帶的吸回峰對應(yīng)α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、β-反平行折疊，但是未發(fā)現(xiàn)無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。除清蛋白以外，其他3 種蛋白組分的二級結(jié)構(gòu)含量：β-折疊＞α-螺旋＞β-轉(zhuǎn)角＞β-反平行折疊。醇溶蛋白的β-轉(zhuǎn)角以及β-反平行折疊結(jié)構(gòu)含量比其他3 種蛋白組分更豐富，并與其他蛋白結(jié)構(gòu)含量差異顯著（P＜0.05）。