傅美娟，鄧 健，羅佳茜，林 雪，李從發(fā)，劉四新,2,*

（1.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570228；2.海南大學(xué)理學(xué)院，海南 ?？?570228）

細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是某些細(xì)菌合成的由多個D-吡喃葡萄糖分子通過β-1,4糖苷鍵連接聚合而成的葡聚糖，呈高度持水的凝膠狀[1]。其生物合成的途徑主要包括4步：聚合、分泌、裝配、結(jié)晶。合成過程中涉及到幾個關(guān)鍵酶（如尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、纖維素合成酶、葡萄糖激酶、異構(gòu)酶等）和多種代謝途徑（如磷酸戊糖途徑、糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)和糖異生作用），圖1是早期研究時木醋桿菌（現(xiàn)在名稱為木駒形桿菌[2]）合成BC的主要碳代謝途徑[3]。

圖1 木醋桿菌合成BC的代謝途徑Fig. 1 Biosynthesis pathways of bacterial cellulose by Acetobacter xylinum

目前，BC在國內(nèi)食品工業(yè)中應(yīng)用最廣泛，被稱為椰纖果、椰果、椰子凝膠等[4]。BC是區(qū)別于植物纖維素（常含半纖維素、木質(zhì)素等）的納米級高純度纖維素，其具有高純度、高結(jié)晶度和聚合度、抗張強度、保水性、生物可降解性和生物適應(yīng)性等優(yōu)良特性[5-9]，所以BC被高附加值地應(yīng)用于高級造紙、生物醫(yī)藥、醫(yī)學(xué)組織工程材料和紡織材料等研究領(lǐng)域[10-12]。因此對于BC的高效發(fā)酵工藝及其調(diào)控機制研究十分必要。

用于發(fā)酵生產(chǎn)BC的研究涉及到各種原料，均以提高產(chǎn)率和降低成本為目標(biāo)[13]，包括椰子水[14]、酒廠廢水[15]、玉米漿[16]、果汁[17]、水解液[18]等，其中以椰子水為主要原料產(chǎn)量最高、效率最好。由于椰子水主要產(chǎn)于熱帶地區(qū)且不易貯存，因此，目前對于椰子水高效合成BC方面的研究鮮有報道。本團(tuán)隊前期一直從事椰子水基質(zhì)合成BC的研究，發(fā)現(xiàn)新鮮椰子水（natural coconut water，NCW）需經(jīng)過自然預(yù)發(fā)酵過程，才能成為較好的合成BC的培養(yǎng)基原料，發(fā)酵生產(chǎn)的得率最終呈倍數(shù)增長[19-20]。Zhang Jiaochao等[21]、楊一沖[22]采用宏基因組學(xué)方法研究椰子水自然預(yù)發(fā)酵過程中微生物的組成及動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)其中存在乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等各類種屬不同的復(fù)雜微生物區(qū)系。本研究提出以膜過濾法處理預(yù)發(fā)酵椰子水（fermented coconut water，F(xiàn)CW），有效避開“熱效應(yīng)”的不利影響和干擾，以探究FCW中菌體及其代謝產(chǎn)物對BC的合成作用，為進(jìn)一步探明促進(jìn)BC合成的“關(guān)鍵成分”及其調(diào)控影響機制提供新的研究思路和重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與試劑

NCW：?？诩信l(fā)椰子果，破殼取水，3 層紗布過濾，迅速分裝至干凈的礦泉水瓶中，置于-20 ℃速凍備用。

FCW：將已分裝至礦泉水瓶的新鮮椰子水存于室溫下，使其自然發(fā)酵至7 d，于-20 ℃速凍備用。

椰凍駒形桿菌（Komagataeibacter nataicola）Y19由海南大學(xué)食品生物技術(shù)實驗室保藏[23]。

硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、蔗糖、冰醋酸、氫氧化鈉（均為分析純） 廣州化學(xué)試劑公司；葡萄糖酸、D-酒石酸、草酸、L-蘋果酸、L-乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸（均為色譜純） 北京索萊寶科技有限公司；甲醇（色譜純） 美國Tedia公司；仲辛醇（色譜純） 美國阿拉丁試劑公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

BC發(fā)酵培養(yǎng)基：3 g/L (NH4)2SO4、0.3 g/L MgSO4·7H2O、0.3 g/L KH2PO4，50%椰子水（新鮮/預(yù)發(fā)酵），50%蒸餾水，pH 5.0，調(diào)節(jié)糖度至6 °Brix。115 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

PB303-N電子分析天平、Delta320-S pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；Biofuge primo R高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技有限公司；SPX智能型生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；G154DW自動壓力蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；SW-CJ超凈工作臺 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；1200液相色譜儀、HP6890/5973N氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 FCW膜濾處理及培養(yǎng)基的設(shè)置

將FCW在9 000 r/min條件下離心20 min后，取上清液配制BC發(fā)酵培養(yǎng)基，以0.45 μm膜抽濾除菌得到膜濾上清液組培養(yǎng)基（以下簡稱FCW-M）；取離心菌體及濾膜上截留菌體添加（帶濾膜）至NCW中，得到菌體組BC發(fā)酵培養(yǎng)基（以下簡稱FCW-P），分別設(shè)NCW和FCW培養(yǎng)基為陰性和陽性對照，每個組設(shè)3 個重復(fù)。全部培養(yǎng)基調(diào)pH 5.0，后三者經(jīng)121 ℃、15 min滅菌。

1.3.2 BC的發(fā)酵及產(chǎn)量測定

將已活化好的Y19二級種子液以2%接種量分別接種到上述4 種發(fā)酵培養(yǎng)基中（100 mL三角瓶裝液量50 mL），30 ℃靜置培養(yǎng)7 d，回獲BC膜。

水洗、浸泡于NaOH稀溶液中80 ℃水浴保溫直至BC膜呈乳白色，依次以稀乙酸中和、去離子水洗直至pH值呈中性，置于80 ℃烘箱烘至恒質(zhì)量。產(chǎn)量以干質(zhì)量（g/L）計。

1.3.3 氣相色譜-質(zhì)譜測定條件

色譜條件：DB-5毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；恒定流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為氦氣（99.999%）；程序升溫：初始溫度40 ℃，保持6 min，以3 ℃/min升溫至120 ℃，然后以4 ℃/min升溫至230 ℃。

質(zhì)譜條件：電子電離源；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍30～450 u；采集方式為全掃描；溶劑延遲3 min。

定性定量分析：采用對總離子流色譜圖中的各個峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后的質(zhì)譜圖，與質(zhì)譜儀自帶的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)MSWORKSTATION version7.0.NIST譜庫檢索，并結(jié)合保留指數(shù)和查閱相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行人工譜圖解析，定性分析，獲得初步的鑒定結(jié)果。樣品定量分析采用內(nèi)標(biāo)法。

1.3.4 高效液相色譜法測定有機酸組成

分別測定FCW-M和NCW中的有機酸組成。將待測樣品于9 000 r/min離心20 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾到進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣量10 μL，結(jié)果用回歸方程計算各成分含量。

色譜條件：Z O R B A X-S B-A q色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；紫外檢測器；檢測波長210 nm；柱溫30 ℃；流速0.8 mL/min，流動相為pH 2.3磷酸溶液；進(jìn)樣量10 μL。采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics V20.0軟件進(jìn)行均值、方差分析和Pearson相關(guān)性分析，采用Duncan檢驗方法（P＜0.05，差異顯著；P＜0.01，差異極顯著）；使用GraphPad Prism 5.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 FCW-M組和FCW-P組對BC合成的影響

圖2 預(yù)發(fā)酵7 d的FCW中上清液和菌體對BC合成的影響Fig. 2 Effects of filtrate and bacterial cell residue of 7 d fermented coconut water on BC synthesis

如圖2所示，膜濾液組FCW-M的BC產(chǎn)量為陰性對照組NCW的10 倍，呈極顯著差異，而只比陽性對照組FCW產(chǎn)量稍低，但無極顯著差異（P＞0.01），說明膜濾液中含有與未經(jīng)過濾的FCW幾乎相同，且對BC合成有極顯著促進(jìn)作用的未知成分。FCW-P的BC產(chǎn)量僅有1.56 g/L，但從差異分析上發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組NCW也存在極顯著性（P＜0.01），可能是因為菌體經(jīng)熱滅菌后死亡、崩解，菌體碎片提供了BC發(fā)酵合成的生長因子等營養(yǎng)成分，但其對BC的促進(jìn)顯著弱于FCW-M組（增產(chǎn)10 倍）和FCW組（增產(chǎn)10.5 倍）。說明椰子水經(jīng)過預(yù)發(fā)酵后顯著促進(jìn)BC合成的主要貢獻(xiàn)來自預(yù)發(fā)酵中微生物的未知代謝產(chǎn)物，而且可能涉及BC合成代謝通路上的調(diào)控因子，而非普通的菌體生長營養(yǎng)成分（如氨基酸核苷酸類等生長因子）。

2.2 預(yù)發(fā)酵時間對FCW-M組和FCW-P組合成BC影響程度的比較

圖3 預(yù)發(fā)酵過程中FCW-M和FCW-P對BC產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effects of filtrate and bacterial cell residue with different fermentation times on BC yield

2.1 節(jié)僅表明預(yù)發(fā)酵時間7 d時的FCW中FCW-M組對BC合成有顯著促進(jìn)作用，故繼續(xù)探究預(yù)發(fā)酵過程中（1～7 d）每個時間點是否都存在類似的規(guī)律，如圖3所示，預(yù)發(fā)酵前4 d 3 組BC產(chǎn)量差異顯著（P＜0.05），F(xiàn)CW-M組對BC產(chǎn)量的促進(jìn)作用沒有得到體現(xiàn)，預(yù)發(fā)酵后期（5～7 d）FCW組和FCW-M組的BC產(chǎn)量明顯提高，F(xiàn)CW-M組第3天的BC產(chǎn)量較第1天僅提高2.8 倍，直到第7天提高12.5 倍，此時組內(nèi)顯著性差異分析發(fā)現(xiàn)，預(yù)發(fā)酵第5天時FCW組的BC產(chǎn)量與FCW-M組無顯著性（P＞0.05），與FCW-P組存在顯著差異（P＜0.05），預(yù)發(fā)酵第6、7天時FCW組與FCW-P組的差異達(dá)到極顯著（P＜0.01）。結(jié)果表明，F(xiàn)CW-M組對BC產(chǎn)量的促進(jìn)作用主要集中在預(yù)發(fā)酵后期，推測可能是FCW-M中不同種微生物積累的某類“促進(jìn)作用”代謝產(chǎn)物不斷增加，也可能是某一類微生物所產(chǎn)該“促進(jìn)作用代謝產(chǎn)物”濃度不斷增大。上清液和菌體促進(jìn)BC合成的時間響應(yīng)程度差異再次說明促進(jìn)BC合成貢獻(xiàn)最大的是FCW-M，而非菌體，推測預(yù)發(fā)酵過程產(chǎn)生了對BC合成有重要調(diào)控作用的代謝產(chǎn)物。

并且實驗發(fā)現(xiàn)膜濾的速度隨椰子水預(yù)發(fā)酵時間而顯著不同，呈逐漸加快的趨勢，預(yù)發(fā)酵1、3、5 d和7 d的椰子水膜濾平均速率約為0.33、6、10 mL/min和15 mL/min，推測預(yù)發(fā)酵過程中，微生物將椰子水中的糖類、蛋白質(zhì)類以及其他可能的帶黏性類物質(zhì)逐漸分解利用，使體系的黏度降低，而加快了過濾除菌的速度。椰子水培養(yǎng)基體系的黏度變化是否對BC合成產(chǎn)生影響，以及預(yù)發(fā)酵超過7 d后的BC產(chǎn)量情況，值得進(jìn)一步研究。

2.3 FCW-M的成分分析

圖4 NCW（A）和FCW-M（B）的氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖Fig. 4 GC-MS total ion current chromatograms of NCW (A) and FCW-M (B)

表1 GC-MS分析結(jié)果Table 1 GC-MS analysis of volatile compounds of NCW and FCW-M

2.1 節(jié)和2.2節(jié)結(jié)果表明FCW-M對BC的產(chǎn)量有顯著促進(jìn)作用，說明預(yù)發(fā)酵過程產(chǎn)生了對BC合成有重要調(diào)控作用的代謝產(chǎn)物。因此對NCW、FCW-M進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析比較，結(jié)果如圖4、表1所示。NCW共檢出76 種化合物，醇類和醛類所占比例最大，達(dá)2/3以上，醇類相對含量約為46%。FCW-M共檢出66 種化合物，醇類相對含量最高，約占62%。從化合物的總含量上分析，NCW中能檢出的揮發(fā)性成分含量較少，F(xiàn)CW-M中的成分總量約為NCW的5 倍。FCW-M中的醇類及酸類的含量遠(yuǎn)超過NCW，但醛類相對含量遠(yuǎn)低于NCW，說明椰子水經(jīng)預(yù)發(fā)酵后醇類和酸類物質(zhì)變化較大。FCW-M中的醇類物質(zhì)以乙醇為主，酸類物質(zhì)以乙酸為主，F(xiàn)CW-M中的乙醇質(zhì)量濃度（2 149.615 μg/L）是NCW（483.416 μg/L）的4.5 倍，乙酸質(zhì)量濃度（522.808 μg/L）是NCW（10.95 μg/L）的48 倍，乙酸、乙醇質(zhì)量濃度的增加與BC產(chǎn)量的提高具有一致性，說明乙酸和乙醇可能參與菌種Y19的代謝調(diào)節(jié)而影響B(tài)C的合成。另一方面，預(yù)發(fā)酵后醛類物質(zhì)減少，也可能減弱了BC合成過程中的負(fù)調(diào)控，值得深入研究。

根據(jù)國內(nèi)外其他人的研究，Li Yuanjing等[24]為改善BC的合成，在發(fā)酵過程中將乙醇和檸檬酸鈉加入培養(yǎng)基中，指出乙醇快速氧化所產(chǎn)生的高能荷三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）是戊糖磷酸途徑中6-磷酸葡萄糖脫氫酶的抑制劑，從而使代謝流量更多的進(jìn)入BC合成方方。Sakurai等[25]采用DNA微陣列技術(shù)分析了乙醇作用下A. acetiNBRC 14818細(xì)胞生長過程中轉(zhuǎn)錄組的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開始氧化乙醇后，乙醛酸途徑酶基因顯著上調(diào)，說明該途徑對乙醇作為碳源的利用具有重要意義。Mohammadkazemi等[26]研究乙酸對K. xylinusI 2281合成BC的影響，表明乙酸可以被活化成乙酰輔酶A進(jìn)入乙醛酸途徑，經(jīng)糖異生作用形成葡萄糖，而利于BC的生物合成。類似的還有張麗平等[27]研究發(fā)現(xiàn)乳酸、乙酸、蘋果酸等對木醋桿菌合成BC有促進(jìn)作用，馬霞等[28]研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中含有乳酸鹽或甲硫氨酸，能加速細(xì)胞生長，提高纖維素產(chǎn)量。因此，推斷椰子水經(jīng)預(yù)發(fā)酵后乙酸和乙醇含量的增加對BC的合成途徑具有一定的正調(diào)控作用。

2.4 椰子水預(yù)發(fā)酵過程中有機酸的變化分析

圖5結(jié)果顯示，在椰子水整個預(yù)發(fā)酵過程中乙酸、乳酸和葡萄糖醛酸為主體酸，含量較豐富，其次是檸檬酸、蘋果酸、酒石酸和琥珀酸等。椰子水經(jīng)預(yù)發(fā)酵后其中乳酸及乙酸含量呈持續(xù)上升趨勢，表明FCW中乳酸菌、酵母菌及醋酸菌生長活躍。BC產(chǎn)量（圖2）結(jié)果與此對應(yīng)，將FCW 1、3、5 d和7 d的BC產(chǎn)量與乙酸、乙醇含量經(jīng)Pearson相關(guān)性分析（圖6）可知，乙酸和乳酸含量與BC產(chǎn)量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.690和0.712，可能說明乳酸和乙酸的增長對BC合成起到促進(jìn)作用。BC合成是一個需要消耗大量ATP的過程，乳酸和乙酸可進(jìn)入三羧酸循環(huán)，參與胞內(nèi)代謝并產(chǎn)生大量ATP，較多的能量可以促進(jìn)BC的合成[29-30]。經(jīng)過1～2 d預(yù)發(fā)酵后椰子水中葡萄糖酸含量降低，至第3天達(dá)最低，此時其BC產(chǎn)量（圖2）增長也達(dá)顯著。葡萄糖酸是葡萄糖-6-磷酸的氧化產(chǎn)物，其含量的降低說明葡萄糖-6-磷酸進(jìn)入經(jīng)變位酶后生成尿苷二磷酸葡萄糖的途徑，從而使BC得以順利合成、顯示其產(chǎn)量進(jìn)入快速增長階段[31-32]。檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸和草酸等幾種有機酸在發(fā)酵過程中變化不顯著，這些有機酸是三羧酸循環(huán)中常見的中間產(chǎn)物，從對BC的合成途徑影響看可能性不大，說明預(yù)發(fā)酵過程中產(chǎn)醋酸、乳酸的微生物可能對BC產(chǎn)量的影響較大。

圖5 椰子水預(yù)發(fā)酵過程中FCW-M的有機酸含量Fig. 5 Changes in organic acid contents of FCW-M during the fermentation of coconut water

圖6 BC產(chǎn)量與L-乳酸（A）、乙酸（B）的相關(guān)性分析Fig. 6 Correlation analysis of BC yield with L-lactic acid (A) and acetic acid (B)

3 結(jié) 論

本實驗將椰子水在預(yù)發(fā)酵FCW中的菌體與上清液分開，研究其對BC合成產(chǎn)生顯著促進(jìn)性影響的可能原因。結(jié)果顯示，在預(yù)發(fā)酵7 d時FCW-M組與FCW組的BC產(chǎn)量無極顯著差異（P＞0.01），而菌體沉淀組FCW-P對BC的促進(jìn)作用顯著弱于FCW-M組和FCW組。從不同預(yù)發(fā)酵時間角度比較時，組內(nèi)顯著性分析發(fā)現(xiàn)預(yù)發(fā)酵前期（1～4 d）FCW-M組的BC產(chǎn)量與FCW組差異顯著（P＜0.05），此時FCW-M對BC的促進(jìn)作用沒有得到體現(xiàn)，后期（5～7 d）可能由于預(yù)發(fā)酵中微生物積累的某類“促進(jìn)作用”代謝產(chǎn)物種類不斷增加或是“促進(jìn)作用代謝產(chǎn)物”濃度不斷增大，F(xiàn)CW-M組的BC產(chǎn)量與FCW組在極顯著水平無差異（P＞0.01），說明FCW-M中存在對BC合成有重要調(diào)控的代謝產(chǎn)物。因此，由進(jìn)一步的氣相色譜-質(zhì)譜法和高效液相色譜法對FCW-M預(yù)發(fā)酵過程中的揮發(fā)性成分和有機酸成分分析，初步推測預(yù)發(fā)酵椰子水中的乙酸、乳酸和乙醇很可能參與促進(jìn)BC合成的調(diào)控過程。本研究以膜濾除菌代替加熱滅菌、避開“熱效應(yīng)”的干擾影響，揭示了椰子水預(yù)發(fā)酵中是代謝產(chǎn)物而非菌體對BC合成的促進(jìn)性影響發(fā)揮了最關(guān)鍵作用的規(guī)律，解答了“預(yù)發(fā)酵過程是否提供了酵母膏樣生長因子”的質(zhì)疑問題。下步擬將以代謝組學(xué)技術(shù)分析FCW中的各差異代謝物，并進(jìn)一步解析預(yù)發(fā)酵過程與BC合成代謝的調(diào)控過程之間的相關(guān)關(guān)系，為最終研究BC的代謝調(diào)控路徑及調(diào)控機理提供理論基礎(chǔ)。