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        松仁清蛋白抗氧化肽的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

        2020-01-07 03:17:56盧紅妍劉詩(shī)夢(mèng)閔偉紅
        食品科學(xué) 2019年24期
        關(guān)鍵詞:松仁谷胱甘肽組分

        盧紅妍,楊 行,方 麗,劉詩(shī)夢(mèng),閔偉紅,*

        (1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118;2.小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,吉林 長(zhǎng)春 130118)

        氧化應(yīng)激是指機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多活性氧簇自由基,超出機(jī)體清除能力,導(dǎo)致體內(nèi)氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡[1]。而體內(nèi)氧化還原狀態(tài)失衡與慢性代謝性疾病,如心腦血管疾病、糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和癌癥發(fā)生、發(fā)展等有關(guān)[2-4]。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)生物活性肽可調(diào)節(jié)血脂、清理血栓、預(yù)防高血壓和神經(jīng)退行性疾病[5-7]等,同時(shí)研究證明,從芝麻粉、蛋清、比目魚肌肉和大麻籽等[8-10]蛋白中提取的小分子質(zhì)量活性肽均具有較強(qiáng)的抗氧化活性,并且富含疏水性氨基酸和巰基、羥基基團(tuán)的肽具有較好的抗氧化活性[11-12]。

        長(zhǎng)白山松仁(Pinus konaiensis Sieb. et Zucc.)為松科植物紅松的種子仁,蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)16.7%[13],富含人體所需的8 種必需氨基酸,是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白來(lái)源。其中松仁清蛋白占總蛋白含量的38.71%,且清蛋白的暴露巰基和總巰基含量最高[14]。因此,松仁清蛋白可作為抗氧化肽制備來(lái)源。

        本研究以松仁清蛋白為原料,采用堿性蛋白酶制備高抗氧化活性肽,通過(guò)現(xiàn)代色譜分離技術(shù)進(jìn)行純化,利用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(electrospray tandem mass spectrometer,ESIMS/MS)儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,在此基礎(chǔ)上,合成結(jié)構(gòu)明確的松仁清蛋白活性肽,并對(duì)其進(jìn)行活性驗(yàn)證。為松仁資源的開(kāi)發(fā)利用及抗氧化肽的深度研究提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        長(zhǎng)白山松仁清蛋白為實(shí)驗(yàn)室自制,通過(guò)堿溶酸沉法和Osborne法制備[15]。

        堿性蛋白酶 丹麥諾維信公司;熒光素鈉、2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、菲洛嗪、SephadexG-25、SephadexG-15美國(guó)Sigma公司;偶氮二異丁脒鹽酸鹽(2,2’-azobis[2-methylpropionamidine] dihydrochloride,AAPH) 美國(guó)SECOMA公司;其他均為國(guó)產(chǎn)分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        UV-1700型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司;FD-1B-50型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;ZY-1000切方流超濾系統(tǒng) 上海紫裕生物科技有限公司;SPECTRA-MAX190型酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司;DBS全自動(dòng)部分回集器 上海嘉鵬科技有限公司;HD-21-88紫外檢測(cè)器 上海琪特分析儀器有限公司;2695高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀 美國(guó)Waters公司;Q Exactive四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

        1.3 方法

        1.3.1 松仁清蛋白肽的制備

        以松仁清蛋白為原料,選用堿性蛋白酶進(jìn)行水解,最佳酶解工藝條件:酶解溫度57 ℃,pH 9.5,加酶量8 600 U/g,質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%,反應(yīng)時(shí)間150 min。酶解產(chǎn)物凍干備用。

        1.3.2 抗氧化活性測(cè)定

        氧自由基吸回能力(oxygen radical absorbance capacity,ORAC)測(cè)定參照Ou等[16]的方法;ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力測(cè)定參照Kong Baohua等[17]的方法;DPPH自由基清除能力測(cè)定參照Xie Zhengjun等[18]的方法;羥自由基清除能力測(cè)定參照Amarowicz等[19]的方法;以上實(shí)驗(yàn)均以谷胱甘肽為陽(yáng)性對(duì)照。鐵離子螯合能力測(cè)定參照Lee等[20]的方法,以乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)為陽(yáng)性對(duì)照。

        1.3.3 肽酶解液的超濾

        對(duì)松仁清蛋白酶解產(chǎn)物的超濾分離選用切方流超濾系統(tǒng)及Biomax改良聚醚砜復(fù)合膜包,膜包截流分子質(zhì)量分別為10 kDa和3 kDa,控制恒流泵進(jìn)口壓力為1.5 bar,回流壓力為0.4 bar,將獲得的3 個(gè)組分冷凍干燥,測(cè)定其抗氧化活性。

        1.3.4 SephadexG-25、SephadexG-15凝膠層析

        基于超濾的抗氧化活性結(jié)果,選擇最優(yōu)組分進(jìn)行SephadexG-25層析分離,樣品質(zhì)量濃度100 mg/mL,上樣量15 mL,洗脫流速1.5 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm,分別回集各峰組分,凍干后測(cè)定抗氧化活性。選取活性最好組分進(jìn)一步經(jīng)SephadexG-15純化,樣品質(zhì)量濃度80 mg/mL,上樣量1.5 mL,洗脫流速0.8 mL/min,280 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè),分別回集各組分,凍干后測(cè)定各組分抗氧化活性。

        1.3.5 反相高效液相色譜(reversed phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)分離

        將SephadexG-15分離獲得的高抗氧化活性肽經(jīng)Waters HPLC儀進(jìn)一步純化,選用Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱。流動(dòng)相A:水(含0.1%三氟乙酸);B:乙腈(含0.1%三氟乙酸)。樣品質(zhì)量濃度40 mg/mL,上樣量50 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。洗脫條件:0~30 min,95%~70% A;30~40 min,70% A;40~60 min,70%~95% A。每次洗脫結(jié)束平衡色譜柱15 min,按圖譜回集各組分,多次上樣,回集凍干。

        1.3.6 質(zhì)譜鑒定

        采用HPLC-ESI-MS/MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,將樣品復(fù)溶于水后經(jīng)由配備在線納噴離子源的LC-MS/MS分析。整套系統(tǒng)為串聯(lián)EASY-nano-LC 1200的Q Exactive Plus質(zhì)譜儀,共上樣8 μL樣品(捕集柱:Acclaim PepMap C18(100 μm×2 cm);分析柱:Acclaim PepMap C18(75 μm×15 cm))。以線性梯度分離:60 min內(nèi)3%~28% B(含0.1%甲酸的ACN溶液)。柱流量控制在300 nL/min,柱溫40 ℃,電噴霧電壓2 kV。

        Q Exactive Plus質(zhì)譜儀在數(shù)據(jù)依賴采集模式下運(yùn)行,自動(dòng)在MS和MS/MS采集間切換。質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置如下:MS:掃描范圍m/z 350~1 650;分辨率70 000;AGC目標(biāo)3e6,最大噴射時(shí)間50 ms,包括電荷狀態(tài)2~7,動(dòng)態(tài)排除時(shí)間auto;HCD-MS/MS:分辨率35 000,隔離窗口1.6,AGC目標(biāo)1e5,最大噴射時(shí)間110 ms,碰撞能量27。

        1.3.7 抗氧化肽的合成

        采用Fmoc固相合成法,由北京中科亞光生物科技有限公司合成。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

        2 結(jié)果與分析

        2.1 酶解液指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

        最佳酶解工藝條件下酶解,酶解液肽質(zhì)量濃度為0.634 mg/mL,水解度為28.98%。酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí),DPPH自由基清除率為73.12%,羥自由基清除率為70.05%,具有較高的抗氧化活性,可用于進(jìn)一步分離純化。

        2.2 超濾組分抗氧化活性

        松仁清蛋白酶解產(chǎn)物經(jīng)超濾獲得3 個(gè)組分,分別為<3 kDa、3~10 kDa和>10 kDa,對(duì)各組分進(jìn)行抗氧化活性驗(yàn)證。ORAC法是一種總抗氧化能力測(cè)定方法,其產(chǎn)生的自由基與生命體系中自由基具有高度一致性[21],因此選取ORAC為主要驗(yàn)證指標(biāo),并以不同反應(yīng)機(jī)制的ABTS陽(yáng)離子自由基、DPPH自由基、羥自由基清除能力和鐵離子鰲合能力4 個(gè)指標(biāo)輔助篩選。

        圖1 超濾組分抗氧化活性Fig. 1 Antioxidant activities of the ultrafiltration fractions

        如圖1所示,在ORAC實(shí)驗(yàn)中,<3 kDa組分抗氧化活性優(yōu)于谷胱甘肽,表現(xiàn)出極顯著差異(P<0.01),而3~10 kDa和>10 kDa組分活性顯著低于谷胱甘肽(P<0.01);在ABTS陽(yáng)離子自由基清除實(shí)驗(yàn)中,<3 kDa組分的自由基清除能力低于谷胱甘肽,而優(yōu)于其他2 個(gè)組分;DPPH自由基和羥自由基清除實(shí)驗(yàn)中,3~10 kDa組分的抗氧化活性最好,優(yōu)于其他2 個(gè)組分;鐵離子鰲合能力實(shí)驗(yàn)中,以EDTA為陽(yáng)性對(duì)照,<3 kDa和3~10 kDa組分在8 mg/mL時(shí),金屬離子鰲合能力與EDTA相當(dāng)。以上各實(shí)驗(yàn)中不同組分間抗氧化活性存在差異,這可能是因?yàn)閴A性蛋白酶作用于不同酶解位點(diǎn),酶解產(chǎn)物中暴露出不同氨基酸殘基,活性肽的供氫或供電子能力存在差異,使各組分具有不同的抗氧化能力。綜合考慮選擇<3 kDa組分進(jìn)一步純化。

        2.3 SephadexG-25、SephadexG-15分離純化及抗氧化活性

        圖2 SephadexG-25凝膠層析圖譜(a)及ORAC(b)Fig. 2 SephadexG-25 chromatogram (a) and ORAC values (b) of eluates

        如圖2a所示,將<3 kDa組分進(jìn)行SephadexG-25凝膠層析色譜分離,獲得4 個(gè)組分,標(biāo)記為B1、B2、B3、B4,回集各組分凍干,進(jìn)行抗氧化活性驗(yàn)證。由圖2b可知,ORAC實(shí)驗(yàn)中,各組分均表現(xiàn)出一定抗氧化能力,且分子質(zhì)量越小ORAC越強(qiáng),與谷胱甘肽相比B4組分表現(xiàn)出極顯著性差異(P<0.01),B3組分與谷胱甘肽的ORAC相當(dāng),而B1與B2組分均低于谷胱甘肽。

        表1 SephadexG-25及SephadexG-15組分抗氧化活性Table 1 Antioxidant activities of on eluates from SephadexG-25 and SephadexG-15 columns%

        在超濾純化組分的測(cè)定中,各組分的抗氧化活性均表現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系,因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,選取質(zhì)量濃度為4 mg/mL進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定。如表1所示,ABTS陽(yáng)離子自由基清除實(shí)驗(yàn)中,B3和B4組分均有較高的自由基清除能力,與谷胱甘肽相比沒(méi)有顯著性差異(P>0.01);在DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)中,各組分間均存在顯著性差異(P<0.01),清除能力依次為:B4>B3>B2>B1;B3組分羥自由基清除能力高于其他3 個(gè)組分;鐵離子鰲合實(shí)驗(yàn)中,B4組分抗氧化活性最好,而B3組分活性較低。研究表明,肽的抗氧化活性與其分子質(zhì)量之間存在相關(guān)性,其活性可能隨著肽分子質(zhì)量的降低而增加,而抗氧化肽的自由基清除作用可能與氨基酸的組成和序列有關(guān)[22]。因B4組分純化獲得數(shù)量極少,綜合考慮,選擇B3組分進(jìn)一步純化。

        圖3 SephadexG-15凝膠層析圖譜(a)及ORAC(b)Fig. 3 SephadexG-15 chromatogram (a) and ORAC values (b) of eluates

        如圖3a所示,B3組分經(jīng)SephadexG-15凝膠層析色譜分離,獲得C1、C2兩個(gè)組分,回集各組分凍干,進(jìn)行抗氧化活性驗(yàn)證。由圖3b可知,ORAC實(shí)驗(yàn)中,C1和C2組分與谷胱甘肽相比沒(méi)有顯著性差異,C2組分ORAC與谷胱甘肽相當(dāng),而C1組分活性較低。

        如表1所示,在ABTS陽(yáng)離子自由基清除實(shí)驗(yàn)中,C1組分清除率為96.50%,C2組分清除率為99.12%;DPPH自由基和羥自由基清除實(shí)驗(yàn)中,C1組分自由基清除能力高于C2組分;而在鐵離子鰲合實(shí)驗(yàn)中,C2組分金屬離子鰲合能力達(dá)到97.82%,與C1組分相比具有顯著性差異(P<0.01)。有文獻(xiàn)報(bào)道稱,反應(yīng)體系中pH值條件對(duì)抗氧化實(shí)驗(yàn)的有較大影響[23],因此推測(cè)針對(duì)不同實(shí)驗(yàn),各組分的清除能力存在差異,可能是因?yàn)楦鹘M分中抗氧化肽具有不同酸性或非中性氨基酸殘基。綜合考慮,選擇C2組分進(jìn)行液相分離。

        2.4 RP-HPLC分離

        圖4 C2組分RP-HPLC圖Fig. 4 RP-HPLC analysis of fraction C2

        如圖4所示,0~10 min內(nèi)出現(xiàn)的是溶劑峰,而樣品峰主要集中在15~45 min內(nèi),樣品峰中存在較多雜峰,說(shuō)明經(jīng)G15純化后樣品純度較低,根據(jù)各峰的分離效果和響應(yīng)值大小,回集5 個(gè)主要的洗脫峰D1、D2、D3、D4、D5,各洗脫峰的保留時(shí)間分別為15.2、17.7、15.5、36.9 min和43.7 min,洗脫峰與總峰面積比分別為7.85%、3.70%、5.98%、9.23%和4.62%。研究表明,經(jīng)RP-HPLC分離,具有較弱極性和非極性物質(zhì)在反相柱上保留時(shí)間長(zhǎng)、出峰時(shí)間晚、疏水性高的特點(diǎn)[24]。D4、D5組分的洗脫峰峰形左右對(duì)稱,純化效果好含量高,且響應(yīng)值較高,可能為主要的效應(yīng)物質(zhì),因此選擇回集D4和D5組分。

        2.5 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

        圖5 FFPY和YLPF二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 5 Tandem mass spectra of FFPY and YLPF

        將D4和D5組分進(jìn)行ESI-MS/MS鑒定,通過(guò)從頭測(cè)序和PEAKS Studio version 8.5分析,獲得序列明確的高抗氧化活性肽。大量研究表明,與親水性氨基酸相比,疏水性氨基酸在高抗氧化活性肽中占更高比例,并且被認(rèn)為是影響肽自由基清除能力的關(guān)鍵因素[25]。另外有報(bào)道稱,芳香族氨基酸(色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe))可以顯著提高肽的抗氧化能力[26]。因此,綜合數(shù)據(jù)庫(kù)查閱結(jié)果和質(zhì)譜可信度分析,從鑒定結(jié)果中選擇氨基酸序列為苯丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-酪氨酸Phe-Phe-Pro-Tyr(FFPY)和酪氨酸-亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸Tyr-Leu-Pro-Phe(YLPF)的活性肽進(jìn)行抗氧化性分析,質(zhì)譜圖如圖5所示。

        2.6 抗氧化肽的合成及驗(yàn)證

        抗氧化肽FFPY和YLPF進(jìn)行化學(xué)合成,分子質(zhì)量分別為572.67 Da和538.65 Da,純度為99.16%和99.91%。對(duì)合成肽FFPY和YLPF進(jìn)行抗氧化活性驗(yàn)證,ORAC值分別為7 329.63 μmol/g和2 835.47 μmol/g,此結(jié)果與先前報(bào)道一致,活性肽中疏水性氨基酸和芳香族氨基酸含量高,具有更好的抗氧化活性[27]。

        3 討論與結(jié)論

        本研究利用ORAC、ABTS陽(yáng)離子自由基、DPPH自由基、羥自由基清除能力和鐵離子鰲合能力5 個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)松仁清蛋白抗氧化肽進(jìn)行分離純化,其中ORAC法是基于氫原子轉(zhuǎn)移的反應(yīng),目前氫原子轉(zhuǎn)移反應(yīng)被認(rèn)為是自由基氧化反應(yīng)的主要機(jī)制[28]。分析表明,在ORAC和ABTS實(shí)驗(yàn)中,各級(jí)組分的分子質(zhì)量越小,抗氧化活性越好,這說(shuō)明肽的抗氧化活性與其分子質(zhì)量大小密切相關(guān)?;趩坞娮愚D(zhuǎn)移的DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)中,松仁清蛋白抗氧化肽可以提供氫供體,與DPPH自由基中心的氮相互作用,從而減少高氧化性自由基,終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng);張德舉[29]研究表明,常見(jiàn)氨基酸中只檢測(cè)到半胱氨酸具有DPPH自由基清除活性,因此純化過(guò)程中,因各組分中半胱氨酸含量及所處位點(diǎn)不同,具有不同的DPPH自由基清除能力。Esteve等[30]研究表明,從橄欖油中提取的小分子質(zhì)量生物活性肽比高分子質(zhì)量活性肽具有更好抗氧化能力,這與此研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)榭寡趸牡臍浠鶊F(tuán)作為氫供體與自由基發(fā)生反應(yīng),而只有這些肽在一定分子質(zhì)量大小內(nèi),氫供體才能最大程度地暴露并與自由基反應(yīng)[31]。

        基于RP-HPLC分離結(jié)果,選擇最優(yōu)組分進(jìn)行ESI-MS/MS分析,獲得序列明確的抗氧化活性肽FFPY和YLPF,分子質(zhì)量分別為572.67 Da和538.65 Da。這與所報(bào)道的典型抗氧化肽一般包含2~9 個(gè)氨基酸,分子質(zhì)量范圍大多在400~950 Da相一致[32]。Zou Tangbin等[33]研究發(fā)現(xiàn),氨基酸組成對(duì)抗氧化活性影響較大,在42 種抗氧化肽中存在人體所含20 種氨基酸,其中甘氨酸、脯氨酸、亮氨酸占氨基酸總數(shù)的33.7%,丙氨酸、酪氨酸和纈氨酸占18.7%;另有研究表明,C-末端和N-末端的氨基酸殘基是影響肽抗氧化活性的關(guān)鍵因素,且C-末端區(qū)域的氨基酸性質(zhì)比N-末端區(qū)域的氨基酸性質(zhì)更重要[34]。本研究中,抗氧化肽FFPY和YLPF中所含氨基酸均為疏水性氨基酸,且75%的氨基酸為組成抗氧化活性肽的主要氨基酸;同時(shí),兩個(gè)肽的C-末端和N-末端氨基酸均為芳香族氨基酸,C-末端為酪氨酸的合成肽FFPY比YLPF具有更高的ORAC。高抗氧化活性肽FFPY和YLPF來(lái)源于松仁清蛋白,這為松仁清蛋白的開(kāi)發(fā)利用提供了參考和依據(jù)。

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