盧紅妍，楊 行，方 麗，劉詩夢，閔偉紅,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118；2.小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

氧化應(yīng)激是指機體內(nèi)產(chǎn)生過多活性氧簇自由基，超出機體清除能力，導(dǎo)致體內(nèi)氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡[1]。而體內(nèi)氧化還原狀態(tài)失衡與慢性代謝性疾病，如心腦血管疾病、糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和癌癥發(fā)生、發(fā)展等有關(guān)[2-4]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)生物活性肽可調(diào)節(jié)血脂、清理血栓、預(yù)防高血壓和神經(jīng)退行性疾病[5-7]等，同時研究證明，從芝麻粉、蛋清、比目魚肌肉和大麻籽等[8-10]蛋白中提取的小分子質(zhì)量活性肽均具有較強的抗氧化活性，并且富含疏水性氨基酸和巰基、羥基基團的肽具有較好的抗氧化活性[11-12]。

長白山松仁（Pinus konaiensis Sieb. et Zucc.）為松科植物紅松的種子仁，蛋白質(zhì)量分數(shù)達16.7%[13]，富含人體所需的8 種必需氨基酸，是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白來源。其中松仁清蛋白占總蛋白含量的38.71%，且清蛋白的暴露巰基和總巰基含量最高[14]。因此，松仁清蛋白可作為抗氧化肽制備來源。

本研究以松仁清蛋白為原料，采用堿性蛋白酶制備高抗氧化活性肽，通過現(xiàn)代色譜分離技術(shù)進行純化，利用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（electrospray tandem mass spectrometer，ESIMS/MS）儀進行結(jié)構(gòu)鑒定，在此基礎(chǔ)上，合成結(jié)構(gòu)明確的松仁清蛋白活性肽，并對其進行活性驗證。為松仁資源的開發(fā)利用及抗氧化肽的深度研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長白山松仁清蛋白為實驗室自制，通過堿溶酸沉法和Osborne法制備[15]。

堿性蛋白酶 丹麥諾維信公司；熒光素鈉、2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、菲洛嗪、SephadexG-25、SephadexG-15美國Sigma公司；偶氮二異丁脒鹽酸鹽（2,2’-azobis[2-methylpropionamidine] dihydrochloride，AAPH） 美國SECOMA公司；其他均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1700型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；FD-1B-50型冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；ZY-1000切方流超濾系統(tǒng) 上海紫裕生物科技有限公司；SPECTRA-MAX190型酶標儀 美國Molecular Devices公司；DBS全自動部分回集器 上海嘉鵬科技有限公司；HD-21-88紫外檢測器 上海琪特分析儀器有限公司；2695高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Waters公司；Q Exactive四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 松仁清蛋白肽的制備

以松仁清蛋白為原料，選用堿性蛋白酶進行水解，最佳酶解工藝條件：酶解溫度57 ℃，pH 9.5，加酶量8 600 U/g，質(zhì)量分數(shù)2%，反應(yīng)時間150 min。酶解產(chǎn)物凍干備用。

1.3.2 抗氧化活性測定

氧自由基吸回能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）測定參照Ou等[16]的方法；ABTS陽離子自由基清除能力測定參照Kong Baohua等[17]的方法；DPPH自由基清除能力測定參照Xie Zhengjun等[18]的方法；羥自由基清除能力測定參照Amarowicz等[19]的方法；以上實驗均以谷胱甘肽為陽性對照。鐵離子螯合能力測定參照Lee等[20]的方法，以乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）為陽性對照。

1.3.3 肽酶解液的超濾

對松仁清蛋白酶解產(chǎn)物的超濾分離選用切方流超濾系統(tǒng)及Biomax改良聚醚砜復(fù)合膜包，膜包截流分子質(zhì)量分別為10 kDa和3 kDa，控制恒流泵進口壓力為1.5 bar，回流壓力為0.4 bar，將獲得的3 個組分冷凍干燥，測定其抗氧化活性。

1.3.4 SephadexG-25、SephadexG-15凝膠層析

基于超濾的抗氧化活性結(jié)果，選擇最優(yōu)組分進行SephadexG-25層析分離，樣品質(zhì)量濃度100 mg/mL，上樣量15 mL，洗脫流速1.5 mL/min，檢測波長280 nm，分別回集各峰組分，凍干后測定抗氧化活性。選取活性最好組分進一步經(jīng)SephadexG-15純化，樣品質(zhì)量濃度80 mg/mL，上樣量1.5 mL，洗脫流速0.8 mL/min，280 nm波長下進行檢測，分別回集各組分，凍干后測定各組分抗氧化活性。

1.3.5 反相高效液相色譜（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）分離

將SephadexG-15分離獲得的高抗氧化活性肽經(jīng)Waters HPLC儀進一步純化，選用Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱。流動相A：水（含0.1%三氟乙酸）；B：乙腈（含0.1%三氟乙酸）。樣品質(zhì)量濃度40 mg/mL，上樣量50 μL，檢測波長220 nm。洗脫條件：0～30 min，95%～70% A；30～40 min，70% A；40～60 min，70%～95% A。每次洗脫結(jié)束平衡色譜柱15 min，按圖譜回集各組分，多次上樣，回集凍干。

1.3.6 質(zhì)譜鑒定

采用HPLC-ESI-MS/MS進行結(jié)構(gòu)鑒定，將樣品復(fù)溶于水后經(jīng)由配備在線納噴離子源的LC-MS/MS分析。整套系統(tǒng)為串聯(lián)EASY-nano-LC 1200的Q Exactive Plus質(zhì)譜儀，共上樣8 μL樣品（捕集柱：Acclaim PepMap C18（100 μm×2 cm）；分析柱：Acclaim PepMap C18（75 μm×15 cm））。以線性梯度分離：60 min內(nèi)3%～28% B（含0.1%甲酸的ACN溶液）。柱流量控制在300 nL/min，柱溫40 ℃，電噴霧電壓2 kV。

Q Exactive Plus質(zhì)譜儀在數(shù)據(jù)依賴采集模式下運行，自動在MS和MS/MS采集間切換。質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置如下：MS：掃描范圍m/z 350～1 650；分辨率70 000；AGC目標3e6，最大噴射時間50 ms，包括電荷狀態(tài)2～7，動態(tài)排除時間auto；HCD-MS/MS：分辨率35 000，隔離窗口1.6，AGC目標1e5，最大噴射時間110 ms，碰撞能量27。

1.3.7 抗氧化肽的合成

采用Fmoc固相合成法，由北京中科亞光生物科技有限公司合成。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解液指標測定結(jié)果

最佳酶解工藝條件下酶解，酶解液肽質(zhì)量濃度為0.634 mg/mL，水解度為28.98%。酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度為4 mg/mL時，DPPH自由基清除率為73.12%，羥自由基清除率為70.05%，具有較高的抗氧化活性，可用于進一步分離純化。

2.2 超濾組分抗氧化活性

松仁清蛋白酶解產(chǎn)物經(jīng)超濾獲得3 個組分，分別為＜3 kDa、3～10 kDa和＞10 kDa，對各組分進行抗氧化活性驗證。ORAC法是一種總抗氧化能力測定方法，其產(chǎn)生的自由基與生命體系中自由基具有高度一致性[21]，因此選取ORAC為主要驗證指標，并以不同反應(yīng)機制的ABTS陽離子自由基、DPPH自由基、羥自由基清除能力和鐵離子鰲合能力4 個指標輔助篩選。

圖1 超濾組分抗氧化活性Fig. 1 Antioxidant activities of the ultrafiltration fractions

如圖1所示，在ORAC實驗中，＜3 kDa組分抗氧化活性優(yōu)于谷胱甘肽，表現(xiàn)出極顯著差異（P＜0.01），而3～10 kDa和＞10 kDa組分活性顯著低于谷胱甘肽（P＜0.01）；在ABTS陽離子自由基清除實驗中，＜3 kDa組分的自由基清除能力低于谷胱甘肽，而優(yōu)于其他2 個組分；DPPH自由基和羥自由基清除實驗中，3～10 kDa組分的抗氧化活性最好，優(yōu)于其他2 個組分；鐵離子鰲合能力實驗中，以EDTA為陽性對照，＜3 kDa和3～10 kDa組分在8 mg/mL時，金屬離子鰲合能力與EDTA相當(dāng)。以上各實驗中不同組分間抗氧化活性存在差異，這可能是因為堿性蛋白酶作用于不同酶解位點，酶解產(chǎn)物中暴露出不同氨基酸殘基，活性肽的供氫或供電子能力存在差異，使各組分具有不同的抗氧化能力。綜合考慮選擇＜3 kDa組分進一步純化。

2.3 SephadexG-25、SephadexG-15分離純化及抗氧化活性

圖2 SephadexG-25凝膠層析圖譜（a）及ORAC（b）Fig. 2 SephadexG-25 chromatogram (a) and ORAC values (b) of eluates

如圖2a所示，將＜3 kDa組分進行SephadexG-25凝膠層析色譜分離，獲得4 個組分，標記為B1、B2、B3、B4，回集各組分凍干，進行抗氧化活性驗證。由圖2b可知，ORAC實驗中，各組分均表現(xiàn)出一定抗氧化能力，且分子質(zhì)量越小ORAC越強，與谷胱甘肽相比B4組分表現(xiàn)出極顯著性差異（P＜0.01），B3組分與谷胱甘肽的ORAC相當(dāng)，而B1與B2組分均低于谷胱甘肽。

表1 SephadexG-25及SephadexG-15組分抗氧化活性Table 1 Antioxidant activities of on eluates from SephadexG-25 and SephadexG-15 columns%

在超濾純化組分的測定中，各組分的抗氧化活性均表現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，因此在后續(xù)實驗中，選取質(zhì)量濃度為4 mg/mL進行抗氧化活性測定。如表1所示，ABTS陽離子自由基清除實驗中，B3和B4組分均有較高的自由基清除能力，與谷胱甘肽相比沒有顯著性差異（P＞0.01）；在DPPH自由基清除實驗中，各組分間均存在顯著性差異（P＜0.01），清除能力依次為：B4＞B3＞B2＞B1；B3組分羥自由基清除能力高于其他3 個組分；鐵離子鰲合實驗中，B4組分抗氧化活性最好，而B3組分活性較低。研究表明，肽的抗氧化活性與其分子質(zhì)量之間存在相關(guān)性，其活性可能隨著肽分子質(zhì)量的降低而增加，而抗氧化肽的自由基清除作用可能與氨基酸的組成和序列有關(guān)[22]。因B4組分純化獲得數(shù)量極少，綜合考慮，選擇B3組分進一步純化。

圖3 SephadexG-15凝膠層析圖譜（a）及ORAC（b）Fig. 3 SephadexG-15 chromatogram (a) and ORAC values (b) of eluates

如圖3a所示，B3組分經(jīng)SephadexG-15凝膠層析色譜分離，獲得C1、C2兩個組分，回集各組分凍干，進行抗氧化活性驗證。由圖3b可知，ORAC實驗中，C1和C2組分與谷胱甘肽相比沒有顯著性差異，C2組分ORAC與谷胱甘肽相當(dāng)，而C1組分活性較低。

如表1所示，在ABTS陽離子自由基清除實驗中，C1組分清除率為96.50%，C2組分清除率為99.12%；DPPH自由基和羥自由基清除實驗中，C1組分自由基清除能力高于C2組分；而在鐵離子鰲合實驗中，C2組分金屬離子鰲合能力達到97.82%，與C1組分相比具有顯著性差異（P＜0.01）。有文獻報道稱，反應(yīng)體系中pH值條件對抗氧化實驗的有較大影響[23]，因此推測針對不同實驗，各組分的清除能力存在差異，可能是因為各組分中抗氧化肽具有不同酸性或非中性氨基酸殘基。綜合考慮，選擇C2組分進行液相分離。

2.4 RP-HPLC分離

圖4 C2組分RP-HPLC圖Fig. 4 RP-HPLC analysis of fraction C2

如圖4所示，0～10 min內(nèi)出現(xiàn)的是溶劑峰，而樣品峰主要集中在15～45 min內(nèi)，樣品峰中存在較多雜峰，說明經(jīng)G15純化后樣品純度較低，根據(jù)各峰的分離效果和響應(yīng)值大小，回集5 個主要的洗脫峰D1、D2、D3、D4、D5，各洗脫峰的保留時間分別為15.2、17.7、15.5、36.9 min和43.7 min，洗脫峰與總峰面積比分別為7.85%、3.70%、5.98%、9.23%和4.62%。研究表明，經(jīng)RP-HPLC分離，具有較弱極性和非極性物質(zhì)在反相柱上保留時間長、出峰時間晚、疏水性高的特點[24]。D4、D5組分的洗脫峰峰形左右對稱，純化效果好含量高，且響應(yīng)值較高，可能為主要的效應(yīng)物質(zhì)，因此選擇回集D4和D5組分。

2.5 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

圖5 FFPY和YLPF二級質(zhì)譜圖Fig. 5 Tandem mass spectra of FFPY and YLPF

將D4和D5組分進行ESI-MS/MS鑒定，通過從頭測序和PEAKS Studio version 8.5分析，獲得序列明確的高抗氧化活性肽。大量研究表明，與親水性氨基酸相比，疏水性氨基酸在高抗氧化活性肽中占更高比例，并且被認為是影響肽自由基清除能力的關(guān)鍵因素[25]。另外有報道稱，芳香族氨基酸（色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe））可以顯著提高肽的抗氧化能力[26]。因此，綜合數(shù)據(jù)庫查閱結(jié)果和質(zhì)譜可信度分析，從鑒定結(jié)果中選擇氨基酸序列為苯丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-酪氨酸Phe-Phe-Pro-Tyr（FFPY）和酪氨酸-亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸Tyr-Leu-Pro-Phe（YLPF）的活性肽進行抗氧化性分析，質(zhì)譜圖如圖5所示。

2.6 抗氧化肽的合成及驗證

抗氧化肽FFPY和YLPF進行化學(xué)合成，分子質(zhì)量分別為572.67 Da和538.65 Da，純度為99.16%和99.91%。對合成肽FFPY和YLPF進行抗氧化活性驗證，ORAC值分別為7 329.63 μmol/g和2 835.47 μmol/g，此結(jié)果與先前報道一致，活性肽中疏水性氨基酸和芳香族氨基酸含量高，具有更好的抗氧化活性[27]。

3 討論與結(jié)論

本研究利用ORAC、ABTS陽離子自由基、DPPH自由基、羥自由基清除能力和鐵離子鰲合能力5 個實驗對松仁清蛋白抗氧化肽進行分離純化，其中ORAC法是基于氫原子轉(zhuǎn)移的反應(yīng)，目前氫原子轉(zhuǎn)移反應(yīng)被認為是自由基氧化反應(yīng)的主要機制[28]。分析表明，在ORAC和ABTS實驗中，各級組分的分子質(zhì)量越小，抗氧化活性越好，這說明肽的抗氧化活性與其分子質(zhì)量大小密切相關(guān)?；趩坞娮愚D(zhuǎn)移的DPPH自由基清除實驗中，松仁清蛋白抗氧化肽可以提供氫供體，與DPPH自由基中心的氮相互作用，從而減少高氧化性自由基，終止自由基鏈式反應(yīng)；張德舉[29]研究表明，常見氨基酸中只檢測到半胱氨酸具有DPPH自由基清除活性，因此純化過程中，因各組分中半胱氨酸含量及所處位點不同，具有不同的DPPH自由基清除能力。Esteve等[30]研究表明，從橄欖油中提取的小分子質(zhì)量生物活性肽比高分子質(zhì)量活性肽具有更好抗氧化能力，這與此研究結(jié)果一致。這可能是因為抗氧化肽的氫基團作為氫供體與自由基發(fā)生反應(yīng)，而只有這些肽在一定分子質(zhì)量大小內(nèi)，氫供體才能最大程度地暴露并與自由基反應(yīng)[31]。

基于RP-HPLC分離結(jié)果，選擇最優(yōu)組分進行ESI-MS/MS分析，獲得序列明確的抗氧化活性肽FFPY和YLPF，分子質(zhì)量分別為572.67 Da和538.65 Da。這與所報道的典型抗氧化肽一般包含2～9 個氨基酸，分子質(zhì)量范圍大多在400～950 Da相一致[32]。Zou Tangbin等[33]研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸組成對抗氧化活性影響較大，在42 種抗氧化肽中存在人體所含20 種氨基酸，其中甘氨酸、脯氨酸、亮氨酸占氨基酸總數(shù)的33.7%，丙氨酸、酪氨酸和纈氨酸占18.7%；另有研究表明，C-末端和N-末端的氨基酸殘基是影響肽抗氧化活性的關(guān)鍵因素，且C-末端區(qū)域的氨基酸性質(zhì)比N-末端區(qū)域的氨基酸性質(zhì)更重要[34]。本研究中，抗氧化肽FFPY和YLPF中所含氨基酸均為疏水性氨基酸，且75%的氨基酸為組成抗氧化活性肽的主要氨基酸；同時，兩個肽的C-末端和N-末端氨基酸均為芳香族氨基酸，C-末端為酪氨酸的合成肽FFPY比YLPF具有更高的ORAC。高抗氧化活性肽FFPY和YLPF來源于松仁清蛋白，這為松仁清蛋白的開發(fā)利用提供了參考和依據(jù)。