劉大偉，周用武，費(fèi)宜玲，謝春平，劉宏毅，魯長虎，侯森林

（1.南京森林警察學(xué)院/野生動植物物證技術(shù)國家林業(yè)局重點實驗室，南京 210023；2.南京林業(yè)大學(xué)，南京 210037）

真菌毒素主要由曲霉菌屬、鐮刀菌屬以及青霉菌屬的真菌產(chǎn)生[1]。農(nóng)作物在田間即可被真菌污染，在運(yùn)輸、加工以及儲存過程中如果環(huán)境條件適合，真菌會繼續(xù)生長，毒素含量也會持續(xù)增加，就目前的技術(shù)手段尚無法完全避免[2]。真菌毒素能夠致癌、致畸和致突變，食用被其污染的食物或飼料將會嚴(yán)重危害人和動物的健康[3-4]。

由飼料受到真菌毒素污染而引發(fā)的圈養(yǎng)野生動物發(fā)病或死亡病例有很多。曾經(jīng)在美國發(fā)生過300 多只圈養(yǎng)美洲鶴（GrusAmericana）、沙丘鶴（G.canadensis）真菌毒素中毒，其中15 只死亡的事件[5]。2006 年，在我國福州大熊貓研究中心發(fā)生了小熊貓霉菌毒素中毒性肝炎的群發(fā)病案。經(jīng)診斷，引起這次發(fā)病的原因是動物飼料受到脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）的污染[6]。鄭先春等[7]報道了一起成年丹頂鶴肝癌死亡的病例，其死因很有可能是動物長期食用了被黃曲霉毒素污染的飼料。這3 個報道只是真菌毒素對圈養(yǎng)野生動物危害的一個縮影。在實際中肯定還有很多野生動物真菌毒素中毒、死亡而沒有被報道的情況發(fā)生。加之在臨床診斷中獸醫(yī)常常會忽視真菌毒素在動物疾病發(fā)生、發(fā)展的作用[8]。因此，圈養(yǎng)野生動物飼料受到真菌毒素污染的問題應(yīng)該得到足夠的重視。

丹頂鶴是全球瀕危物種[9]。有學(xué)者指出，人工條件下進(jìn)行飼養(yǎng)繁育并在適當(dāng)?shù)臅r候進(jìn)行野化放歸是阻止瀕危動物野外滅絕的一種有效的手段[10]。為此，我國很多野生動物園、自然保護(hù)區(qū)、濕地公園開展了這一珍稀鶴類的人工繁育工作。周大慶等[11]報道，目前中國動物園圈養(yǎng)的丹頂鶴主要分布在東北、華北和華東地區(qū)，占全國總數(shù)的74.3%。

在我國，圈養(yǎng)條件下丹頂鶴的食物是各飼養(yǎng)機(jī)構(gòu)各自加工的顆粒飼料。這些飼料的主要成分是容易受到真菌感染的農(nóng)作物及其副產(chǎn)品，如花生、玉米、小麥、豆粕、麩皮、魚粉等。目前，國內(nèi)外為了掌握真菌毒素污染規(guī)律，控制毒素帶來的風(fēng)險，每年都會對各類型飼料及其原料的污染情況進(jìn)行調(diào)查。然而，圈養(yǎng)野生動物所食用的飼料在加工、生產(chǎn)等相關(guān)環(huán)節(jié)上還沒有形成規(guī)?；?、商品化，對于這些飼料中的真菌毒素發(fā)生規(guī)律、污染水平都還沒有受到過關(guān)注。本研究旨在通過對圈養(yǎng)丹頂鶴數(shù)量較多的東北、華北、華東地區(qū)丹頂鶴飼料樣品中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、DON、ZEN、T-2 毒素（T-2 toxin，T-2）和赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）水平的調(diào)查，了解丹頂鶴飼料受到真菌毒素污染的現(xiàn)狀，為預(yù)防和控制真菌毒素污染提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料與儀器

AFB1、DON、ZEN、T-2、OTA 標(biāo)準(zhǔn)毒素（SIGMA公司）；免疫親和柱（R-Biopharm，德國）；色譜級甲醇、乙腈、乙酸（CNW 公司）；三氟乙酸（國產(chǎn)分析純）；GF/C 玻璃纖維濾紙、Whatman No.4 濾紙（上海根利商貿(mào)有限公司）；針式濾器（0.45 μm，CNW 公司）。

LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津）、SPD-20A紫外檢測器（日本島津）、RF-10AXL 熒光檢測器（日本島津）、Inertsil ODS-SP 色譜柱（250 mm×4.6 mm）（日本島津）、Inertsil ODS-SP 色譜柱（150 mm×4.6 mm）（日本島津）、超純水機(jī)（優(yōu)普UPT-II-5T，成都超純科技有限公司）、粉碎機(jī)（XL-04A，廣州旭朗機(jī)械設(shè)備公司）、渦旋振蕩器（WH-1 上海滬西分析儀器廠）、氮吹儀（OA-SYSTMN-EVAPTMIIIOrganomation Associates, JNC）。

1.2 樣品采集

2014 年11 月—2015 年1 月，從東北地區(qū)的吉林向海國家級自然保護(hù)區(qū)和沈陽森林動物園，華北地區(qū)的北京動物園、山東黃河三角洲國家級自然保護(hù)區(qū)和石家莊動物園，華東地區(qū)的江蘇鹽城國家級珍禽自然保護(hù)區(qū)、南京紅山森林動物園和合肥動物園等8 家丹頂鶴飼養(yǎng)機(jī)構(gòu)采集62 份硬顆粒飼料樣品（具體采樣情況見表1）。這些飼料均為各飼養(yǎng)機(jī)構(gòu)按照國家相關(guān)畜禽飼料標(biāo)準(zhǔn)自行配制、生產(chǎn)。樣品經(jīng)干燥后，在水分含量小于14%時進(jìn)行封裝、儲存。在封裝過程中，按照《飼料采樣方法》（GB/T14699.1-2005）[12]要求進(jìn)行采樣。所有樣品均要求達(dá)到500 g，粉碎過20 目篩后密封保存在-20 ℃冰箱中。

表1 不同區(qū)域樣品采集表Table 1 Numbers of samples collected in different regions

1.3 毒素檢測

按照Liu D.W.等[13]的高效液相色譜條件對樣品中AFB1、DON、ZEN、T-2、OTA 含量進(jìn)行檢測，相關(guān)參數(shù)見表2。

表2 樣品中5 種毒素的高效液相色譜參數(shù)Table 2 The HPLC parameters for the analysis of 5 mycotoxins in the feeds

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用Excel 2007 統(tǒng)計檢出率，使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，各地區(qū)間不同毒素水平差異采用One-way ANOVA 進(jìn)行分析，用LSD 法進(jìn)行多重比較。在方差分析前對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗。試驗數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。所有分析中以P＜0.05 代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

62 份飼料樣品中真菌毒素檢測結(jié)果見表3。全部樣品中AFB1、DON、ZEN、T-2、OTA 的檢出率分別為43.54%、90.32%、93.55%、69.35%、74.20%。

根據(jù)國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB13078-2001（2001）[14]、GB13078.3-2007（2007）[15]、GB13078.2-2006（2006）[16]、GB 21693-2008（2008）[17]規(guī)定禽用飼料中AFB1、DON、ZEN、T-2、OTA 的最大允許量分別是20、5 000、500、1 000 和100 μg/kg。對照這些標(biāo)準(zhǔn)，62 份飼料樣品中AFB1、DON、ZEN 的超標(biāo)率分別是3.23%、16.13%、41.94%，T-2 和OTA 的超標(biāo)率為0。

如表4 顯示，東北、華北、華東地區(qū)AFB1的污染率分別為：42.11%、40.00%、47.83%。在污染水平方面，華東地區(qū)為（13.33±2.00）μg/kg，顯著高于華北（8.45±3.28）μg/kg 和東北地區(qū)（5.90±1.46）μg/kg（P＜0.05）。

所有被檢樣品中，DON 的平均檢出率為90.32%，其中華東地區(qū)污染率最高，達(dá)到95.65%。在污染水平方面，東北、華北、華東地區(qū)分別為（791.63±181.66）、（899.36±126.36）和（904.64±174.12）μg/kg，各區(qū)域之間無顯著性差異（P＞0.05），見表5。

由表6 可以看出，東北、華北和華東地區(qū)丹頂鶴飼料中ZEN 的污染率至少為85.00%。其中，華東地區(qū)的污染率達(dá)100%。這3 個地區(qū)ZEN 污染水平分別為（573.93±94.41）、（515.53±43.26）和（720.66±101.95）μg/kg。

在3 個區(qū)域的被檢飼料中，T-2 的污染率分別是68.42%、65.00%、73.91%。在污染水平方面，華北地區(qū)為（76.44±22.13）μg/kg 顯著高于東北地區(qū)（P＜0.05），東北地區(qū)與華東地區(qū)以及華北地區(qū)與華東地區(qū)之間差異不顯著（P＞0.05），見表7。

表3 被檢飼料中真菌毒素污染情況Table 3 Contaminated levels of mycotoxins in all feeds

表8 顯示，來自東北、華北、華東地區(qū)的飼料樣本中OTA 檢出率分別為：63.16%、75.00%和82.61%。在污染水平方面，東北、華北、華東地區(qū)分別為(16.12±4.83)、(15.15±4.30)和(12.30±2.76) μg/kg，各區(qū)域之間無顯著性差異（P＞0.05）。

在本次檢測5 種毒素中，62 份飼料樣品里1 份含1 種毒素（DON），剩余61 份樣品均含兩種及兩種以上的毒素（見表9），其中有21.31%的樣品包含了全部5 種毒素；49.18%的樣品污染了4 種毒素，在混合污染中所占比例最高；污染兩種毒素的樣品比例最少，為11.48%。

不同區(qū)域內(nèi)丹頂鶴飼料中毒素構(gòu)成情況各有不同（見圖1）。在東北地區(qū)，同時含有5 種被檢毒素的飼料比例最高，達(dá)到31.58%，其后是污染兩種毒素（DON+ZEN）的飼料，占15.79%。而在華北地區(qū)，同時污染5 種毒素的飼料只有一份，占到該地區(qū)陽性樣品數(shù)的5%。在該地區(qū)污染DON+ZEN+T-2+OTA的飼料最多，占40.00%。華東地區(qū)，污染AFB1+DON+ZEN+T-2+OTA 和DON+ZEN+T-2+OTA 的飼料比例較高，分別占到26.09%和34.78%。

表4 不同地區(qū)被檢飼料中AFB1 的污染情況Table 4 Occurrence of AFB1 in red-crowned crane's feeds in different regions

表5 不同地區(qū)丹頂鶴飼料中DON 的污染情況Table 5 Occurrence of DON in red-crowned crane's feeds in different regions

表6 不同地區(qū)丹頂鶴飼料中ZEN 的污染情況Table 6 Occurrence of ZEN in red-crowned crane's feeds in different regions

表7 不同地區(qū)被檢飼料中T-2 的污染情況Table 7 Occurrence of T-2 toxin in red-crowned crane's feeds in different regions

表8 不同地區(qū)丹頂鶴飼料中OTA 的污染情況Table 8 Occurrence of OTA in red-crowned crane's feeds in different regions

表9 丹頂鶴飼料中毒素的混合污染情況Table 9 Co-occurrence of mycotoxins in red-crowned crane's feeds

圖1 不同區(qū)域丹頂鶴飼料中毒素組成Figure 1 Combinations of mycotoxins in red-crowned crane's feeds in different regions

3 討論

出于公共食品安全以及相關(guān)經(jīng)濟(jì)利益方面的需要，在人類食品和畜禽飼料工業(yè)領(lǐng)域，真菌毒素污染問題得到了足夠的重視[18]。世界上很多國家根據(jù)其掌握的不同毒素的毒物學(xué)資料、食品和飼料中毒素污染情況、分析方法的有效性及其自身的實際情況制定了不同食物和飼料中各主要真菌毒素的最大限量。而圈養(yǎng)野生動物飼料中的真菌毒素污染問題一直沒有受到重視，也沒有任何相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)。美國農(nóng)業(yè)部和食品藥品管理局對人的食物和家養(yǎng)動物飼料中所含黃曲霉毒素的水平作出了限量標(biāo)準(zhǔn)[19]，然而毒素含量超過限量標(biāo)準(zhǔn)的谷物會被當(dāng)做野生動物飼料進(jìn)行出售[20]。S.E.Henke 等[21]對美國田納西州野鳥飼料中的黃曲霉毒素污染情況進(jìn)行調(diào)查后發(fā)現(xiàn)其中17%的被檢樣品中該毒素含量超過100 μg/kg，最高達(dá)2 780 μg/kg。雖然關(guān)于真菌毒素對野生動物危害的研究很少，但可以肯定食物中的真菌毒素能夠?qū)е乱吧鷦游锏慕】邓絿?yán)重受損，甚至死亡[22]。

在黃曲霉毒素中AFB1被認(rèn)為毒性最強(qiáng)，IARC[23]將其列為一類致癌物。各種動物對AFB1的敏感度均不相同，在禽類中，雛鴨最為敏感[24]。參考雛鴨對AFB1的敏感性，Liu D.W.等[13]推測當(dāng)食物中該毒素濃度為6.2～11.4 mg/kg 時將導(dǎo)致丹頂鶴急性中毒。本次調(diào)查中丹頂鶴飼料中AFB1的污染水平遠(yuǎn)低于這個劑量。

黃曲霉毒素的污染一直是人們關(guān)注的熱點。A.Zinedine 等[25]對摩洛哥市場上出售的禽飼料中AFB1污染情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明飼料中該毒素的最大值為5.38 μg/kg，平均濃度為1.26 μg/kg。T.Gazzotti等[18]對意大利超市出售的高檔狗糧和中檔狗糧中真菌毒素進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)這兩種飼料中AFB1的水平均低于歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)（5 μg/kg）。在本研究中AFB1的平均水平和最大值均高于以上兩個地區(qū)的調(diào)查結(jié)果。在我國，禽類飼料中AFB1的限量標(biāo)準(zhǔn)為20 μg/kg（GB13078-2001，2001）[13]。按照這個標(biāo)準(zhǔn)，來自3 個地區(qū)的被檢飼料中有兩份毒素超標(biāo)，其中華北、華東各1 份，含量分別為22.46 和23.16 μg/kg。在平均水平方面，華東地區(qū)顯著高于其他兩個地區(qū)，這可能與該地區(qū)降雨量較大、平均氣溫偏高等氣候因素有關(guān)。

DON 和ZEN 是幾種在自然界分布較廣泛的鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的主要毒素[26-27]。只要?dú)夂驐l件合適，農(nóng)作物在田間就可以感染相關(guān)的產(chǎn)毒真菌，因此農(nóng)產(chǎn)品很容易被這兩種毒素污染[28]。在本研究中我們也發(fā)現(xiàn)，與其他3種被檢毒素相比，丹頂鶴飼料中DON、ZEN 的污染率較高，3 個地區(qū)的平均污染率達(dá)到85%以上，尤其是華東地區(qū)。從受污染程度來看，3 個地區(qū)被檢飼料中沒有樣品的DON 濃度超過國家限量標(biāo)準(zhǔn)（5 000 μg/kg）。而ZEN 的污染較為嚴(yán)重，被檢的3 個地區(qū)ZEN 的平均含量均超過國家限量標(biāo)準(zhǔn)（500 μg/kg）。周闖等[29]對全國部分地區(qū)禽全價料中真菌毒素進(jìn)行調(diào)查，其中DON 和ZEN的檢出率分別為88.24%、76.92%。本研究結(jié)果與這個報道類似。2003 至2005 年間，E.M.Binder 等[30]對世界范圍內(nèi)真菌毒素調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，亞洲、大洋洲成品飼料中DON 和ZEN 的污染率分別為36.5%、38.3%，平均含量分別為634 和366 μg/kg；歐洲及地中海地區(qū)DON 和ZEN 的污染率分別為56.5%、27.1%，平均含量分別為290 與144 μg/kg。與此相比較，丹頂鶴飼料中DON 和ZEN 無論是污染水平還是在污染率均較高。

T-2 的毒性作用范圍較廣，對植物、細(xì)胞培養(yǎng)物、真菌、原蟲等都能造成一定的危害。世界各國對該毒素的重視程度不同，有些國家對這種毒素進(jìn)行了限定，而有些國家（如歐盟、加拿大）則采取了較為謹(jǐn)慎的做法，沒有規(guī)定法定允許量或執(zhí)行限量，僅以指南或建議的形式提出容忍量。我國的飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB 21693-2008（2008）規(guī)定，禽配合飼料中T-2的含量不允許超過1 000 μg/kg，本次抽檢的所有丹頂鶴飼料樣品中T-2 含量均遠(yuǎn)小于國家限量標(biāo)準(zhǔn)。東北、華北和華東地區(qū)T-2 的平均污染率為69.35%，其中華東地區(qū)最高（73.91%）。與國內(nèi)其他調(diào)查結(jié)果相比，這3 個地區(qū)丹頂鶴飼料中T-2 的污染率和污染水平均較小[31]。

我國配合飼料中OTA 的限量標(biāo)準(zhǔn)與歐盟的規(guī)定一致（100 μg/kg）。本次調(diào)查中，OTA 的污染率為74.20%，無被檢樣品超出限量標(biāo)準(zhǔn)。S.Achille 等[32]對意大利北部的家禽飼料調(diào)查發(fā)現(xiàn)，OTA 的污染率為100%，陽性樣品中毒素含量的范圍是0.04～6.50 μg/kg，超標(biāo)率為0。對西班牙的飼料調(diào)查表明，家禽和蛋雞飼料中OTA 的污染率分別是42.9%、37.5%，污染的平均水平分別是0.05 與0.52 μg/kg，超標(biāo)率均為0[33]。與這些國家禽類飼料中的真菌毒素調(diào)查結(jié)果相比，雖然所有被檢丹頂鶴飼料樣本中無OTA 超標(biāo)，但值得注意的是這些飼料中該毒素的平均污染水平偏高。

與國內(nèi)畜禽飼料相比，東北、華北、華東地區(qū)丹頂鶴飼料中真菌毒素的污染率以及污染水平均不高，且大部分樣品中毒素含量低于國家限量標(biāo)準(zhǔn)。但是，這些限量標(biāo)準(zhǔn)均是基于真菌毒素對生命周期較短的家禽、家畜的影響而制定。在大多數(shù)情況下，低水平的毒素不會導(dǎo)致直接的臨床癥狀，然而它們都會對細(xì)胞、組織以及器官產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷，加速腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程[34]。長期食用被真菌毒素污染的食物或飼料會導(dǎo)致嚴(yán)重的胃腸道疾病和惡性腫瘤[4，35]。因此，使用畜禽飼料中真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)來判定生命周期較長的野生動物飼料是否合格顯然不合適。而且，對于鶴類來講，其免疫系統(tǒng)可能沒有其他禽類發(fā)育的完善[36]，同樣水平的真菌毒素對丹頂鶴健康造成的危害可能會更大。如果長期食用含低水平毒素的飼料可能會造成慢性中毒，增大其對病原微生物的易感性。

食物或者飼料往往同時感染多種真菌，一種真菌一般會產(chǎn)生多種毒素[37]，在實際研究中發(fā)現(xiàn)多種真菌毒素混合污染的現(xiàn)象非常普遍[38]。因此，當(dāng)人和動物受到真菌毒素威脅時，一般是來自多種毒素而不是單獨(dú)的某一種毒素[39]。本次調(diào)查中也發(fā)現(xiàn)丹頂鶴飼料中真菌毒混合污染的比率非常高，62 份被檢飼料中有61 份被兩種及兩種以上的毒素污染，混合污染率為98.41%，且被調(diào)查的3 個地區(qū)丹頂鶴飼料中混合污染的毒素種類數(shù)均較多。這種高混合污染率的情況與在其他國家調(diào)查的結(jié)果相類似[40-41]。由于不同的毒素作用的器官和組織不同，因此混合污染會對動物產(chǎn)生危害是多方面的，對機(jī)體造成的危害程度也遠(yuǎn)比單一毒素大[42]。丹頂鶴飼料中毒素混合污染情況尤其值得各飼養(yǎng)機(jī)構(gòu)的重視。

真菌毒素污染可發(fā)生于飼料及飼料原料生產(chǎn)的任何一個環(huán)節(jié)，而且在飼料制作時的高溫不能夠?qū)⑵渲形廴镜亩舅販缁?。對于圈養(yǎng)野生動物來說，人工投喂的飼料是其唯一的食物來源。飼料中真菌毒素對野生動物的健康產(chǎn)生直接危害，影響珍稀動物種群擴(kuò)大。本次調(diào)查表明，丹頂鶴飼料普遍受到真菌毒素污染，為減輕毒素對動物機(jī)體造成的不利影響，各丹頂鶴飼養(yǎng)機(jī)構(gòu)可以從原料采購、倉儲保管、存放周期、加工除毒素、提高動物機(jī)體免疫力等方面著手做好防范[43-44]。

4 小結(jié)

①中國部分地區(qū)圈養(yǎng)丹頂鶴飼料中，AFB1、DON、ZEN、T-2 和OTA 的污染率分別是43.54%、90.32%、93.55%、69.35%、74.20%。平均含量分別是7.62、871.49、616.34、65.62、14.50 μg/kg。其中，華東地區(qū)樣品中AFB1的含量顯著高于其他兩個地區(qū)；華北地區(qū)樣品中T-2 的含量顯著高于東北地區(qū)。在超標(biāo)率方面，AFB1、DON、ZEN 的超標(biāo)率分別是3.23%、16.13%、41.94%，T-2 和OTA 沒有超標(biāo)。

②在抽檢的62 份飼料樣品里61 份含有2 種及2 種以上的毒素。其中，有21.31%的樣品包含了全部5 種毒素，49.18%的樣品污染了4 種毒素，18.04%的樣品污染了3種毒素，11.48%的樣品污染了2 種毒素。東北地區(qū)飼料中同時含有5 種被檢毒素的飼料比例最高。華北地區(qū)飼料中污染DON+ZEN+T-2+OTA 的飼料比例最高。華東地區(qū)飼料中污染DON+ZEN+T-2+OTA 的飼料的數(shù)量最多。