王 夢，周靖宣，占思遠，王林杰，李 利，張紅平，仲 濤

（四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院/畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點實驗室，成都 611130）

內(nèi)皮素受體（endothelin receptor，EDNR）是結(jié)合內(nèi)皮素配體的視紫紅質(zhì)受體β 組的G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor；GPCR）[1]，具有7 個跨膜結(jié)構(gòu)域，通常由7 個外顯子編碼，N 端在細胞外，C 端在細胞內(nèi)，這決定了內(nèi)皮素受體與G 蛋白結(jié)合后可以參與動物細胞的增殖、遷移、分化和血管生成等多種生理過程[2-3]。內(nèi)皮素受體家族基因主要包括內(nèi)皮素受體A 型基因（EDNRA）和內(nèi)皮素受體B 型基因（EDNRB）[4]。EDNR基因通過與鳥嘌呤-核苷酸結(jié)合（G）蛋白從而激活磷脂酰肌醇-鈣第二信使系統(tǒng)發(fā)揮各種功能。EDNRA基因在羊駝中影響黑色素細胞的形成從而影響毛色的形成，且隨著近現(xiàn)代的深入研究發(fā)現(xiàn)該基因與人類顱面發(fā)育及心血管疾病等有重要關(guān)系[5-7]。EDNRA基因主要在胎盤、心房、腎平滑肌、主動脈、腦血管、肺中分布，最新研究表明它可以參與介導平滑肌細胞的增殖和血管收縮舒張[8]。

內(nèi)皮素（endothelin，ET）通過與受體結(jié)合而誘導信號通路，是目前發(fā)現(xiàn)的最強的血管收縮的物質(zhì)[9]。內(nèi)皮素有3種異構(gòu)體，包括內(nèi)皮素-1（ET-1）、內(nèi)皮素-2（ET-2）、內(nèi)皮素-3（ET-3）[10]。ET-1與EDNRA具有很高的親和力，主要通過下游的這兩個G 蛋白偶聯(lián)受體EDNRA和EDNRB發(fā)揮作用。ET-1誘導表達受體EDNRA的交感神經(jīng)元投射到通向心臟的腔靜脈[11]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮素軸組分（EDNRA、EDNRB、ET-1、ET-3）在髓外造血器官的發(fā)育中有表達[12]。在人類胚胎發(fā)生時期，ET-1-EDNRA軸對稱調(diào)節(jié)顱面和心血管形態(tài)的發(fā)生，內(nèi)皮素通路蛋白與動脈粥樣硬化相關(guān)慢性疾病等血管疾病密切相關(guān)[5，13]。急性腦出血大鼠體內(nèi)內(nèi)皮素表達升高及血漿降鈣素基因相關(guān)肽表達降低[14]。EDNRA的過表達可以促進體外骨髓細胞的增值和抗凋亡能力[15]。在非洲爪蟾中發(fā)現(xiàn)了第三種內(nèi)皮素，被稱為EDNRC，但對其還未有深入研究[10]。

EDNRA基因的表達與其功能有緊密的關(guān)系，但至今有關(guān)EDNRA基因的研究多集中在與人類血管有關(guān)的疾病上，在草食動物尤其是山羊體內(nèi)的研究較少，其在山羊各組織中的表達規(guī)律尚不明確。因此，本試驗以簡州大耳羊為試驗對象，克隆得到EDNRA的cDNA 序列、預測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并通過qPCR 技術(shù)來探究EDNRA在不同組織中的表達規(guī)律，為后續(xù)功能研究提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗動物簡州大耳羊來自四川省簡陽市簡州大耳羊育種場，隨機采集無親緣關(guān)系的3 只2 月齡健康母羊的心臟、肝、脾、肺、腎、大腦和網(wǎng)膜共7 個組織樣品，取各組織樣3～5 g，用無菌生理鹽水處理，迅速置于液氮中帶回試驗室，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄

將提前凍存的樣品在液氮中迅速研磨成粉，采用Trizol（Invitrogen，美國）法提取樣品的總RNA 后用核酸蛋白檢測儀（Bio-Rad，美國）測定RNA 濃度（A260nm/A280nm＞1.8），再經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進一步鑒定。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScrip RT reagent Kit（TaKaRa，Dalian，China）對總RNA 進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，編號后置于-20 ℃保存?zhèn)溆?，RNA 存放于-80 ℃保存?zhèn)溆?/p>

1.2.2 引物設計與合成

下載NCBIGenBank 數(shù)據(jù)庫中公布的山羊EDNRA基因的序列（XM_005691200.3），通過BLAST 對序列進行在線比對，確定EDNRA基因的保守序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設計引物（表1），用于基因的PCR 擴增及克隆測序。再根據(jù)克隆測序得到的山羊EDNRA基因CDS 全長序列及內(nèi)參基因β-Actin序列設計實時定量PCR引物（表1）。引物均由成都擎科生物科技有限公司合成。并通過BLAST工具進行比對檢索和PCR產(chǎn)物測序結(jié)果，驗證引物的特異性。

1.2.3EDNRA基因的克隆與測序

以肝臟組織cDNA 為模板，PCR 擴增山羊EDNRACDS 區(qū)全長序列。PCR 擴增反應體系為30 μL：2×TaqPCR Master Mix 15 μL，ddH2O 11.5 μL，cDNA 0.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.5 μL。PCR 擴增反應條件為：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，退火（溫度見表1）30 s；72 ℃延伸90 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸8 min；12 ℃保存。PCR 產(chǎn)物擴增后，在1.5%瓊脂糖凝膠檢測PCR 擴增產(chǎn)物，紫外凝膠成像儀（Bio-Rad）觀察結(jié)果。使用凝膠回收試劑盒（TIAN gel Midi Purification Kit）純化回收目的片段。將純化回收的產(chǎn)物進行T-A 克隆，將EDNRA序列在16 ℃溫度下連接到pMD19-T 載體上，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α 感受態(tài)細胞，涂布于LB 培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)過夜，挑選單克隆菌落擴大培養(yǎng)，將初步鑒定為陽性克隆的重組質(zhì)粒送成都擎科偉業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4EDNRA的生物信息學分析

對山羊EDNRA基因CDS 區(qū)進行序列分析和蛋白生物信息結(jié)構(gòu)功能預測，分析預測工具見表2。

1.2.5EDNRAqPCR 檢測

根據(jù)克隆得到的山羊EDNRA序列，選用βactin（NM_001009784）作為內(nèi)參基因。采用Primer Premier5.0 軟件設計實時熒光定量引物（表1）。使用Bio-Rad CFX 96 熒光定量PCR 儀檢測目的基因及內(nèi)參的表達量，每組3個重復。反應體系為10 μL：SYBRPremix ExTaqTMⅡ（TaKaRa，Dalian，China）5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，cDNA 模板0.8 μL，ddH2O 3.4 μL。反應條件.：95 ℃預變性30 s；95 ℃5 s，58.5 ℃30 s，39 個循環(huán)；以0.5 ℃/s的速度65 ℃緩慢遞增到95 ℃，同時對熒光信號的變化進行觀察，如果隨著溫度的升高信號強度隨著降低，且形成一個單一的峰，沒有任何雜峰，則說明產(chǎn)物的擴增為特異性的。

表1 引物信息Table 1 Primer information

表2 DNA 和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)分析工具Table 2 DNA and protein sequence data analyses tools

1.3 統(tǒng)計分析

Bio-Rad CFX 96 熒光定量PCR 得到的結(jié)果采用2-ΔΔCt方法分析各目的基因的相對表達量，數(shù)據(jù)均用平均值±標準誤表示，并用SAS 8.0 軟件的GLM過程進行最小二乘分析，Duncan 法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 EDNRA 編碼基因擴增及克隆結(jié)果

根據(jù)羊EDNRA基因mRNA 設計特異性引物，以山羊肝臟cDNA 為模板擴增后，在1.5%瓊脂糖凝膠檢測PCR 產(chǎn)物，紫外凝膠成像儀（Bio-Rad）觀察所獲得目標產(chǎn)物為1 284 bp（圖1）與預期結(jié)果相符?？寺y序結(jié)果顯示，片段大小為1 284 bp，與預期目的條帶大小一致。

圖1 山羊EDNRA 基因PCR 擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 1 Agarose gel electrophoresis of goat EDNRA gene amplified by PCR

2.2 EDNRA 序列分析

根據(jù)測序得到的CDS 全長序列，使用NCBI 的工具ORF Finder 對克隆得到的山羊EDNRA基因序列進行開放閱讀框分析，得知該基因包含一個1 284 bp 的最長開放閱讀框。該序列編碼427 個氨基酸，含信號肽序列（第1 到第20 位氨基酸），以及7 型跨膜受體同系物結(jié)構(gòu)域（圖2）。

2.3 山羊EDNRA 蛋白質(zhì)分析

2.3.1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

在線軟件ProtParam 分析結(jié)果顯示蛋白質(zhì)分子量為48 378.83 g/mol，等電點為8.354。負電荷氨基酸殘基總數(shù)（Asp + Glu）28 個，正電荷氨基酸殘基總數(shù)（Arg+Lys）是36 個。分子式C2200H3428N562O600S33，其不穩(wěn)定系數(shù)為39.07，脂肪系數(shù)為100.87，總平均親水指數(shù)0.325。

圖2 山羊EDNRA 序列分析Figure 2 Sequence analysis of goat EDNRA

2.3.2 蛋白質(zhì)親水性/疏水性分析

關(guān)于蛋白質(zhì)的親水性/疏水性，從ProtScale 預測得到，EDNRA基因編碼的多肽鏈的第312、位存在最大值3.422，疏水性最強。第412 位存在最小值-3.300，親水性最強，整條鏈中親水性氨基酸殘基少于疏水性氨基酸殘基，由此推測該基因編碼的蛋白為疏水性蛋白（圖3）。

2.3.3 蛋白質(zhì)信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)域測分析

從Signal P 4.1 Server 預測信號肽的結(jié)果中可以看出，EDNRA基因在氨基酸序列的第20 和21位存在一個潛在的信號肽斷裂位點，概率為0.450。S 和Y 指標最高點均處于20～21 位區(qū)間，表明EDNRA基因編碼蛋白的1～20 位可能為該蛋白的信號肽，屬于分泌蛋白（圖4）。

PSORT 在線軟件對目的蛋白進行亞細胞定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白存在于細胞外的可能性為0.64，存在高爾基體的可能性為0.46，存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的可能性為0.37，存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的可能性為0.10，因此推測該蛋白屬于膜外蛋白。

2.3.4 潛在磷酸化位點分析

圖3 EDNRA 基因編碼氨基酸疏水性/親水性的預測Figure 3 Prediction of amino acid hydrophobicity/hydrophilicity encoded of EDNRA gene

氨基酸序列潛在磷酸化位點使用在線工具NetPhos 2.0 Server 分析，結(jié)果顯示該序列具有潛在的磷酸化位點，總數(shù)為35，且分別位于絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）3種氨基酸上，其中絲氨酸（Ser）上潛在的磷酸化位點數(shù)最多，為20 個（圖5）。

圖4 EDNRA 基因編碼蛋白信號肽預測Figure 4 Prediction of EDNRA gene coding protein signal peptide

圖5 EDNRA 基因氨基酸序列潛在磷酸化位點分析Figure 5 Analysis of potential phosphorylation sites of amino acid sequence of EDNRA gene

2.3.5 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測

使用SOPMA 預測該蛋白的二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋（44.96%）、延伸鏈（13.58%）、無規(guī)則卷曲（39.11%）和β 轉(zhuǎn)角（2.34%）4 種結(jié)構(gòu)元件組成，其中α-螺旋和無規(guī)則卷曲比例較高（圖6）。

2.3.6 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預測

EDNRA 蛋白可能的三級結(jié)構(gòu)如圖所示（圖7），其主要構(gòu)成依然為α-螺旋、延伸鏈、無規(guī)則卷曲和β 轉(zhuǎn)角，與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)構(gòu)基本一致。其全局模型質(zhì)量估計（Global model quality estimation，GMQE）值為0.66。

2.4 EDNRA 基因相似性及親緣關(guān)系進化樹分析

本研究采用基于系統(tǒng)遺傳學的最大似然法（maximum likelihood）和貝葉斯分析法（Bayesian inference）進行系統(tǒng)發(fā)育的構(gòu)建。在貝葉斯分析中，通過MrModeltest 2.3 中的Akaike information criterion（AIC）選擇在DNA 序列中使用一個一般的時間可逆模型，其中有一定比例的不變位點，位點分布率不同。使用Phyml 引導評估樹的穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)按密碼子位置進行分區(qū)，本研究使用4 個獨立的鏈（每1 000 代取樣一次）進行了500 萬代Bayesian Markov chain Monte Carlo 分析，前50 萬代被丟棄。當分裂頻率的平均標準差小于0.01 時，認為平穩(wěn)性。為了得到一系列的系統(tǒng)發(fā)育距離收集了綿羊（Ovisaries）、牛（Bostaurus）、野牛（Bison）、野豬（Susscrofa）、驢（Equusasinus）、獼猴（Macacamulatta）、人（Homosapiens）、小鼠（Musmusculus）、褐家鼠（Rattusnorvegicus）的EDNRA氨基酸序列。初始數(shù)據(jù)集和完整數(shù)據(jù)集的蛋白質(zhì)序列使用默認參數(shù)設置，分別由MUSCLE對齊，它是發(fā)現(xiàn)的性能最好的對齊程序之一。選擇最小化手工對其編輯來避免引入偏差。PAL2NAL 是一種利用匹配氨基酸序列構(gòu)建多密碼子序列比對的程序，可以精確的獲得序列的核苷酸對比。系統(tǒng)進化如樹圖8 所示。分析結(jié)果表明，山羊EDNRA基因和綿羊、牛以及野牛的親緣關(guān)系較近。

圖6 EDNRA 蛋白二級結(jié)構(gòu)預測Figure 6 Secondary structure prediction of EDNRA protein

圖7 EDNRA 蛋白三級結(jié)構(gòu)預測Figure 7 The tertiary structure prediction of EDNRA protein

2.5 基因的組織表達分析

應用qPCR 的方法檢測了山羊EDNRA基因在心、肝、脾、肺、腎、大腦和網(wǎng)膜組織7 種組織中的表達情況。以β-actin作為內(nèi)參基因，檢測的表達結(jié)果為：山羊EDNRA基因在心臟的表達量最高，在肝、脾、腎、大腦、網(wǎng)膜組織中的表達量較低，而在肺中表達最少（圖9）。

3 討論

本研究通過克隆獲得了山羊該基因CDS 全序列，EDNRA基因編碼區(qū)長度為1 284 bp，位于17號染色體上。EDNRA基因編碼427 個氨基酸。蛋白質(zhì)分子量為48 378.83 g/mol，分子式C2200H3428N562O600S33，等電點為8.353，負電荷氨基酸殘基總數(shù)（Asp + Glu）28 個，正電荷氨基酸殘基總數(shù)（Arg + Lys）是36個。其不穩(wěn)定系數(shù)為39.07，脂肪系數(shù)為100.87，總平均親水指數(shù)0.325。信號肽預測發(fā)現(xiàn)EDNRA基因在氨基酸序列存在潛在的信號肽，屬于分泌蛋白，這表明了該蛋白可以轉(zhuǎn)運到不同膜結(jié)構(gòu)的亞細胞器內(nèi)，并發(fā)揮相應的功能。據(jù)對目的蛋白的亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)該蛋白存在于細胞外的可能性較大，適應于G蛋白偶聯(lián)受體的功能，信號間傳導通過細胞膜信號傳導器G 蛋白將信息通過活化的受體從細胞外傳到細胞內(nèi)[3]。氨基酸序列存在潛在磷酸化位點，總數(shù)為35，且分別位于絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）3種氨基酸上，其中絲氨酸（Ser）上潛在的磷酸化位點數(shù)最多，為20 個，這使細胞間的各種信號可以有效傳遞和交流。該氨基酸序列與綿羊（Ovisaries）、牛（BosTaurus）、豬（Susscrofa）、人（Homosapiens）、小鼠（Musmusculus）的相似性分別為98.59%、98.13%、94.61%、93.68%和90.40%。這與氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹結(jié)果保持一致，也進一步證實了EDNRA序列在物種間具有高度保守性。通過在核苷酸和氨基酸水平上的同源比對分析，結(jié)果表明山羊EDNRA同源性與綿羊、牛、野牛相似度較高，即分類學觀點也得到印證，即都屬反芻亞目，?？啤Ｔ诘鞍踪|(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)中主要以α-螺旋為主。

圖8 哺乳動物EDNRA 基因系統(tǒng)進化樹Figure 8 Phylogenetic tree of EDNRA gene in mammals

圖9 EDNRA 基因在7 種組織中的表達Figure 9 Expression of EDNRA gene in 7 tissues

山羊EDNRA基因qPCR 檢測結(jié)果表明，EDNRA基因在山羊心臟中高表達，在肝、脾、腎、大腦和網(wǎng)膜中低表達，在肺臟內(nèi)幾乎不表達。推測EDNRA在心臟行使其功能的過程中發(fā)揮重要，這與Honore Jean-Claude 等[14]的研究一致。內(nèi)皮素是軸突生長的一般介質(zhì)，指導由動脈構(gòu)成的交感神經(jīng)細胞軸突的發(fā)育，軸突支配和控制著大量的靶細胞，包括外分泌腺和內(nèi)分泌腺的導管，腸和血管的平滑肌層，心肌和節(jié)點等[16]。心臟是動物的重要器官，參與血管中的血液循環(huán)，由心臟傳導系統(tǒng)調(diào)節(jié)的自身的協(xié)調(diào)收縮是生存所必需的[17]。有研究表明，在發(fā)育中的雞胚中，EDNRA在心肌細胞中表達，心肌細胞內(nèi)皮素信號傳導足以誘導雞的心肌細胞轉(zhuǎn)分化為外周浦肯野纖維，進而影響心臟傳導系統(tǒng)[18]。EDNRA缺失的胚胎心臟常表現(xiàn)為心室壁發(fā)育不全，有絲分裂活性低，Tbx5表達降低，Tbx2表達呈倒數(shù)擴張[19]。EDNRA是對血管有舒張和收縮作用的因子[20]。EDNRA基因在內(nèi)皮素通路中的作用較為關(guān)鍵，容易受到基因變異的影響，內(nèi)皮素系統(tǒng)對血管內(nèi)皮功能的任何改變都可能導致其病理生理學改變[21]。在人類和動物模型中的研究表明，ET-1和EDNRA信號在正常顱面發(fā)育過程中和咽弓的形成模式有重要作用[22-23]。在小鼠的試驗中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子SIX1通過抑制背部內(nèi)胚層內(nèi)皮素1 的表達來調(diào)控背弓發(fā)育，從而阻止背側(cè)EDNRA信號的傳遞[24]。還有研究發(fā)EDNRA可能在藏雞胚胎對缺氧的適應中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用[25]，這可能與血管中紅細胞數(shù)量有關(guān)。這些功能研究在山羊中還未見報道，因此，EDNRA的具體功能和作用機制還有待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究成功獲得山羊EDNRA基因CDS 序列1 284 bp，編碼427 個氨基酸，在物種間保守程度較高。EDNRA 蛋白含信號肽序列（第1 到第20 位氨基酸），以及7 型跨膜受體同系物結(jié)構(gòu)域，編碼產(chǎn)物具有疏水性，屬分泌蛋白，存在35 個潛在的磷酸化位點，分別位于絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）3種氨基酸位點上。其二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋，彎曲折疊后形成復雜的三級結(jié)構(gòu)。親緣關(guān)系進化樹分析發(fā)現(xiàn)山羊EDNRA基因和綿羊、牛以及野牛的親緣關(guān)系較近。 qPCR 檢測結(jié)果表明，山羊EDNRA基因在心臟中高表達，在肝、脾、腎、大腦、網(wǎng)膜組織中的表達量較低，而在肺中表達最少。本試驗為進一步研究EDNRA在山羊心臟中的功能作用奠定基礎。