汪夢(mèng)雯，劉文婷，任雪寧，鄭 雪，胡 松，楊 苗，夏 飛

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

0 引言

茯茶是一種后發(fā)酵黑茶，具有降血脂、減肥、抗氧化和抗腹瀉等[1-3]功效.以黑毛茶為原料經(jīng)過(guò)毛茶篩分、汽蒸、渥堆、壓制成型、發(fā)花、干燥和成品包裝等工藝制成[4].“金花菌”是茯茶發(fā)酵中的優(yōu)勢(shì)菌群，是一種無(wú)毒無(wú)害，符合安全標(biāo)準(zhǔn)要求，并對(duì)人體健康有益的菌群[5-7].茯茶中的活性多糖具有降血壓、降血脂、抗腫瘤、保肝護(hù)肝、抗氧化、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)等生物活性[8,9].多糖的多種生物活性，引起很多研究者的關(guān)注.目前認(rèn)為多糖可通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)人體的新陳代謝，一是通過(guò)清除活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)維持機(jī)體自由基平衡以達(dá)到抗氧化防御；其次可通過(guò)影響腸道菌群調(diào)節(jié)和改善胃腸道微環(huán)境，達(dá)到防治腹瀉的作用.此外，也可通過(guò)調(diào)節(jié)益生菌來(lái)激活吞噬細(xì)胞，提高機(jī)體免疫力.然而，目前茯茶多糖的抗氧化活性及其對(duì)益生菌生長(zhǎng)的影響作用還尚未完全闡釋清楚.

從茯茶中有效提取茯茶多糖環(huán)節(jié)是限制其開(kāi)發(fā)利用的瓶頸.目前，茯茶多糖通常采用熱水浸提、酸堿浸提、酶和超聲波輔助浸提等方法[10].由于茯茶多糖為水溶性多糖，且熱水浸提法操作簡(jiǎn)單、成本較低，因此該方法是提取茯茶多糖最常采用的一種方法.然而，由于提取原料的差異，多糖得率往往不高、提取過(guò)程較長(zhǎng).采用超聲輔助處理可促進(jìn)細(xì)胞壁破碎，胞內(nèi)多糖溶出，從而提高多糖得率以及縮短提取時(shí)間.合理結(jié)合熱水浸提和超聲處理提取茯茶多糖的工藝目前仍需進(jìn)行探索.

為探索茯茶多糖最佳提取工藝及茯茶多糖的體外抗氧化和對(duì)益生菌生長(zhǎng)規(guī)律的影響.本研究通過(guò)優(yōu)化浸提時(shí)間、超聲時(shí)間、超聲功率和料液比四個(gè)因素，對(duì)超聲輔助熱水浸提法提取茯茶多糖工藝進(jìn)行優(yōu)化,并探討茯茶多糖的體外抗氧化活性和對(duì)腸道益生菌生長(zhǎng)的規(guī)律的影響.從而為茯茶功效的研究和高附加值茯茶多糖食品開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料及菌種

市售茯茶，實(shí)驗(yàn)室保藏菌種：乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)，戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)，凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)，屎腸球菌(EnterococcusFaecium)均為本研究室保存.

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母菌粉、吐溫80、檸檬酸二胺、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、無(wú)水乙醇、95%乙醇、丙酮、濃硫酸、苯酚，以上試劑均為分析純.

采用MRS培養(yǎng)基[11]，其中加入2%的瓊脂即為MRS固體培養(yǎng)基.

1.1.3 主要儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(SP-752PC)，上海光譜儀器有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器(LS-C50L)，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;冷凍干燥機(jī)(CTFD-10S)，青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司;數(shù)控超聲波清洗器(KQ-300VDB)，昆山市超聲儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52A)，上海亞榮生化儀器廠.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茯茶多糖提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以茯茶多糖得率為考察指標(biāo)，分別考察浸提時(shí)間、超聲時(shí)間、超聲功率和料液比四個(gè)因素對(duì)茯茶多糖得率的影響.在浸提溫度為100 ℃條件下：分別選取浸提時(shí)間[12]為30 min、60 min、90 min、120 min和150 min，固定超聲時(shí)間為20 min,超聲功率300 W，料液比為1∶30；超聲時(shí)間[13]為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，固定浸提時(shí)間為90 min，超聲功率為300 W，料液比為1∶30；超聲功率[12]為180 W、210 W、240 W、270 W和300 W，固定超聲時(shí)間為20 min，浸提時(shí)間為90 min，料液比為1∶30；料液比[14]為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50，固定超聲時(shí)間為20 min，超聲功率為300 W，浸提時(shí)間為90 min.提取的茯茶多糖進(jìn)行冷凍干燥，茯茶多糖的含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法進(jìn)行[15].

1.2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以浸提時(shí)間、超聲時(shí)間、液料比為自變量，利用Design Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行三因素三水平Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，如表1所示.

表1 茯茶多糖響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

1.2.3 茯茶多糖體外抗氧化活性

將提取的茯茶多糖配制成1 mg/mL的母液，并稀釋至0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL，備用.分別測(cè)定茯茶多糖的總還原力[16]、DPPH自由基清除率[17]、超氧陰離子清除率[12]和羥基自由基清除率[18]，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次，以同濃度的Vc作為陽(yáng)性對(duì)照.

1.2.4 茯茶多糖對(duì)益生菌生長(zhǎng)的影響

將乳酸乳球菌(L.lactis)，戊糖片球菌(P.pentosaceus)，凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)和屎腸球菌(E.faecium)在MRS固體培養(yǎng)基上活化后，接入液體MRS培養(yǎng)基，制備種子液.

將茯茶多糖添加至液體培養(yǎng)基中，使其質(zhì)量濃度分別為0 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL.分別接入2 mL四種待測(cè)菌種子液，進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的測(cè)定.菌液在37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每隔2 h取菌液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度值.以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，分別繪制四菌株在不同茯茶多糖濃度時(shí)的生長(zhǎng)曲線.以未加入茯茶多糖的培養(yǎng)基為對(duì)照組.

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果表示為Means±SD，采用ORIGIN(Origin Pro V 9.0)作圖.采用Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行方差分析，顯著水平為P<0.05，極顯著水平為P<0.01.

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 浸提時(shí)間對(duì)茯茶多糖得率的影響

單因素篩選浸提時(shí)間結(jié)果表明，多糖得率隨浸提時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)(圖1(a)).這是因?yàn)榻釙r(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致其他物質(zhì)溶出，影響茯茶多糖的得率[19,20].在90 min時(shí)茯茶多糖得率達(dá)到最大值，為3.59%.因此選擇最佳浸提時(shí)間為90 min.

2.1.2 超聲時(shí)長(zhǎng)對(duì)茯茶多糖得率的影響

超聲時(shí)長(zhǎng)對(duì)茯茶多糖得率的影響如圖1(b)所示.隨著超聲時(shí)間的增加，茯茶多糖得率呈先增加后下降的趨勢(shì).這可能是由于超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致茯茶多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞而使茯茶多糖得率下降[13].當(dāng)超聲時(shí)長(zhǎng)為30 min時(shí)，茯茶多糖得率最高可達(dá)3.20%.因此最佳超聲時(shí)間選擇30 min.

2.1.3 超聲功率對(duì)茯茶多糖得率的影響

超聲功率在180～300 W范圍時(shí)，茯茶多糖得率整體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，240 W時(shí)多糖得率最低,如圖1(c)所示.超聲功率為180 W時(shí)，茯茶多糖得率最高為2.93%，比超聲功率240 W時(shí)茯茶多糖得率高0.13%.綜合考慮茯茶多糖得率和成本損耗，選擇最佳超聲功率為180 W.

2.1.4 料液比對(duì)茯茶多糖得率的影響

料液比在1∶10～1∶30范圍時(shí)，茯茶多糖得率呈上升趨勢(shì)，如圖1(d)所示，料液比1∶30時(shí)達(dá)到最大值，為2.95%.液料比的增加可以有效促進(jìn)水溶性多糖物質(zhì)的溶出，而溶劑用量過(guò)大會(huì)造成茯茶多糖濃度過(guò)低，后續(xù)濃縮、沉淀等操作步驟繁多，造成部分多糖損失，導(dǎo)致茯茶多糖得率下降[21,22].由此確定最佳料液比選擇1∶30.

(a)浸提時(shí)間對(duì)茯茶多糖得率的影響

(b)超聲時(shí)間對(duì)茯茶多糖得率的影響

(c)超聲功率對(duì)茯茶多糖得率的影響

(d)料液比對(duì)茯茶多糖得率的影響圖1 單因素對(duì)茯茶多糖得率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化茯茶多糖的提取工藝

2.2.1 Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以浸提時(shí)間(A)、超聲時(shí)間(B)、料液比(C)設(shè)計(jì)三因素三水平共17組響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)如表2所示.從表2可初步看出茯茶多糖得率最高的提取方案：浸提時(shí)間為90 min，超聲時(shí)間為30 min，料液比為1∶30時(shí)茯茶多糖得率最高為3.62%.

表2 Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性分析

以茯茶多糖得率為響應(yīng)值，對(duì)中心組合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，獲得擬合的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=3.57+0.09A+0.081C+0.018A-0.089B+0.12AC-0.048BC-0.43A2-0.54B2-

0.42C2.

表3 回歸方程方差分析

注：“***”表示差異極顯著(P<0.001)；“**”表示差異非常顯著(P<0.01)；“*”表示差異顯著(P<0.05)；“-”表示差異不顯著.

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

采用Design Expert8.0.6軟件繪制得到響應(yīng)面曲面圖和等高線圖，如圖2所示.通過(guò)改變研究試驗(yàn)范圍內(nèi)的兩個(gè)因子并將另一個(gè)因子保持在零水平來(lái)形成模型的表面響應(yīng)圖，以確定任何獨(dú)立變量對(duì)茯茶多糖得率的影響[24].等高線圖的形狀為橢圓時(shí)，表示兩因素相互作用顯著；其形狀為圓形時(shí)表示兩因素相互作用不顯著[14,25].浸提時(shí)間在76～112 min范圍、超聲時(shí)間在25～36 min范圍時(shí)，有較高的多糖得率；超聲時(shí)間對(duì)茯茶多糖得率的影響大于浸提時(shí)間，如圖2(a)所示.響應(yīng)面曲線(圖2(d))坡度較陡，表明浸提時(shí)間和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)茯茶多糖得率影響顯著(P<0.05).

由圖2(b)可知，當(dāng)料液比在1∶22.5～35、浸提時(shí)間在73.5～113 min范圍內(nèi)，茯茶多糖有較高的得率；浸提時(shí)間對(duì)茯茶多糖得率的影響大于液料比，如圖2(b)所示.響應(yīng)面曲線坡度較陡，如圖2(e)所示，表明浸提時(shí)間和料液比的交互作用對(duì)茯茶多糖得率有影響，但通過(guò)方差分析浸提時(shí)間和料液比的交互作用不顯著.

當(dāng)超聲時(shí)間在25～36.5 min、料液比在1∶23.5～30之間時(shí)，茯茶多糖有最高得率；超聲時(shí)間對(duì)茯茶多糖得率的影響大于液料比(如圖2(c)所示).而響應(yīng)曲面的坡度較陡(如圖2(f)所示)，表明超聲時(shí)間和料液比的相互作用對(duì)茯茶多糖得率影響較大.

(a)超聲時(shí)間與浸提時(shí)間對(duì)茯茶多糖得率影響曲面圖

(b)浸提時(shí)間和料液比對(duì)茯茶多糖得率影響曲面圖

(d)超聲時(shí)間與浸提時(shí)間對(duì)茯茶多糖得率影響平面分析

(f)超聲時(shí)間和料液比對(duì)茯茶多糖得率影響平面分析圖圖2 各交互因素作用的響應(yīng)面圖和等高線圖

2.2.4 優(yōu)化提取參數(shù)和驗(yàn)證模型

Design Expert 8.0.6軟件分析得到茯茶多糖提取的最佳工藝條件為：浸提時(shí)間93.64 min、超聲時(shí)間30.72 min、料液比1∶29.02，在該條件下預(yù)測(cè)茯茶多糖提取率為3.58%.根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整最佳提取工藝為浸提時(shí)間93 min，超聲時(shí)間30 min，料液比1∶29.為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可靠性，在此條件下進(jìn)行兩次重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得茯茶多糖提取率平均值為3.62%，相對(duì)誤差為1.05%，實(shí)測(cè)值與理論值之間的擬合度較好，表明利用響應(yīng)面法對(duì)茯茶多糖提取工藝的優(yōu)化是可行的.

2.3 茯茶多糖的益生作用

2.3.1 茯茶多糖抗氧化活性

茯茶多糖總還原力如圖3(a)所示.茯茶多糖濃度與總還原力之間存在一定的量效關(guān)系，當(dāng)茯茶多糖濃度為0.1 mg/mL時(shí)，其吸光值為0.17 A，為對(duì)照組Vc吸光值的24.37%.與靈芝孢子粉多糖的體外抗氧化活性相比，1.0 mg/mL靈芝孢子粉多糖的總還原力為0.47 A[26]，而茯茶多糖濃度為0.6 mg/mL時(shí)，其總還原力為0.67 A，較靈芝孢子粉多糖的總還原力強(qiáng).

隨著濃度增加，茯茶多糖對(duì)DPPH自由基的清除力整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，如圖3(b)所示.當(dāng)濃度為0.3 mg/mL時(shí)達(dá)到最高值為70.03%，此濃度Vc對(duì)DPPH的清除力為92.85%.而3 mg/mL的枸杞多糖對(duì)DPPH自由基的清除率為80.41%[27]，可以推測(cè)，茯茶多糖對(duì)DPPH的清除能力極可能強(qiáng)于枸杞多糖.

茯茶多糖對(duì)超氧陰離子的清除力隨濃度增加而增加，如圖3(c)所示.茯茶多糖為0.1 mg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子的清除率僅為9.64%，當(dāng)茯茶濃度增加至0.4 mg/mL和0.6 mg/mL時(shí)，茯茶多糖對(duì)超氧陰離子的清除率顯著提高.而陽(yáng)性對(duì)照Vc組對(duì)超氧陰離子的清除率在80%以上.

茯茶多糖對(duì)羥基自由基也表現(xiàn)出一定的清除力，如圖3(d)所示.茯茶多糖濃度為0.1 mg/mL時(shí)對(duì)羥基自由基的清除率為18.66%，同濃度Vc對(duì)羥基自由基對(duì)清除率為55.75%.當(dāng)茯茶多糖濃度為0.6 mg/mL時(shí)，其對(duì)羥基自由基的清除率增加至23.76%，而0.6 mg/mL靈芝孢子粉多糖對(duì)羥基自由基的清除力為56.50%，靈芝子實(shí)體多糖對(duì)羥基自由基清除力為52.26%[26].因此，濃度為0.6 mg/mL時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除力表現(xiàn)為：靈芝孢子粉多糖>靈芝子實(shí)體多糖>茯茶多糖.雖然茯茶多糖對(duì)羥基自由基清除率不及靈芝孢子粉及靈芝子實(shí)體多糖，然而茯茶多以夏秋茶為原料加工，因此，研究茯茶多糖的抗氧化活性及其高附加值產(chǎn)品的加工，對(duì)于剩余茶葉資源的開(kāi)發(fā)利用具有重要的意義.

(a)茯茶多糖的總還原力

(b)茯茶多糖對(duì)DPPH自由基的清除力

(c)茯茶多糖對(duì)超氧陰離子的清除力

2.3.2 茯茶多糖對(duì)益生菌生長(zhǎng)規(guī)律的影響

茯茶多糖的添加對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌、戊糖片球菌、屎腸球菌表現(xiàn)出抑制作用.如圖4(a)所示，茯茶多糖的添加對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌的菌量生長(zhǎng)整體表現(xiàn)出一定的抑制作用，且隨著培養(yǎng)基中茯茶多糖濃度增加，對(duì)菌量生長(zhǎng)的抑制作用有一定的增加趨勢(shì).戊糖片球菌也受到抑制作用.

如圖4(b)所示，在茯茶多糖濃度分別為1 mg/mL、2 mg/mL和4 mg/mL時(shí)，對(duì)戊糖片球菌的生長(zhǎng)有抑制作用.5 mg/mL的茯茶多糖對(duì)戊糖片球菌前期菌量生長(zhǎng)有顯著抑制作用(P<0.05)，而在菌體生長(zhǎng)16 h后，顯著促進(jìn)戊糖片球菌菌量的增加(P<0.05).

茯茶多糖在對(duì)屎腸球菌的生長(zhǎng)具有較明顯的抑制作用(如圖4(c)所示)，且5 mg/mL茯茶多糖對(duì)屎腸球菌的生長(zhǎng)抑制非常顯著(P<0.01).茯茶多糖對(duì)乳酸乳球菌生長(zhǎng)的影響隨濃度變化差異較大，如圖4(d)所示.茯茶多糖濃度為0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL時(shí)，菌體生長(zhǎng)量與對(duì)照組基本相似.3 mg/mL茯茶多糖較顯著抑制乳酸乳球菌菌量的生長(zhǎng)(P<0.05)；而隨茯茶多糖濃度增加至5 mg/mL時(shí)，對(duì)菌量生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用(P<0.05).

多糖類物質(zhì)對(duì)益生菌的生長(zhǎng)并沒(méi)有明確的濃度和效應(yīng)關(guān)系.猴頭菇多糖對(duì)益生菌的生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用，7 mg/mL的猴頭菇多糖顯著促進(jìn)保加利亞乳桿菌和青春雙歧桿菌的生長(zhǎng)[28]，而4 mg/mL牛蒡菊糖對(duì)雙歧桿菌卻產(chǎn)生抑制作用[29].本研究中茯茶多糖對(duì)益生菌生長(zhǎng)的影響作用并不是隨著濃度的升高而增加，與白術(shù)多糖對(duì)雙歧桿菌的生長(zhǎng)的影響相似：劉麗莎等[30]發(fā)現(xiàn)白術(shù)多糖對(duì)雙歧桿菌的生長(zhǎng)作用并不是濃度越高對(duì)雙歧桿菌促進(jìn)生長(zhǎng)越明顯.茯茶多糖對(duì)戊糖片球菌(P.pentosaceus)、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)以及屎腸球菌(E.faecium)的生長(zhǎng)整體表現(xiàn)出抑制作用.這與白術(shù)多糖對(duì)雙歧桿菌的生長(zhǎng)作用相似，白術(shù)多糖濃度超過(guò)2 mg/mL時(shí)，對(duì)B.infanits,B.adolescentis和B.animalis的生長(zhǎng)促進(jìn)作用逐呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[30].此外，白術(shù)多糖對(duì)B.lottgum和B.bifidum的生長(zhǎng)促進(jìn)作用不顯著[30].而0～2 mg/mL的白術(shù)多糖較明顯促進(jìn)B.infanits,B.adolescentis和B.animalis三種益生菌的生長(zhǎng).

(b)不同濃度的茯茶多糖對(duì)戊糖片球菌生長(zhǎng)的影響

(c)不同濃度的茯茶多糖對(duì)屎腸球菌生長(zhǎng)的影響

(d)不同濃度的茯茶多糖對(duì)乳酸乳球菌生長(zhǎng)的影響圖4 茯茶多糖對(duì)益生菌生長(zhǎng)規(guī)律的影響(**表示P<0.01，*表示P<0.05)

3 結(jié)論

本研究獲得茯茶多糖最佳提取工藝為：浸提時(shí)間90 min、超聲時(shí)間30 min、料液比1∶30、超聲功率180 W，在該條件下，茯茶多糖得率為3.69%.通過(guò)測(cè)定茯茶多糖的總還原力、DPPH自由基、超氧陰離子和羥基自由基的清除能力，表明茯茶多糖具有較好的抗氧化作用.茯茶多糖在體外對(duì)戊糖片球菌(P.pentosaceus)、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)以及屎腸球菌(E.faecium)的生長(zhǎng)具有一定抑制作用，濃度為3 mg/mL的茯茶多糖對(duì)乳酸乳球菌表現(xiàn)出抑制作用，而濃度為5 mg/mL時(shí)對(duì)菌量體生長(zhǎng)具有明顯促進(jìn)作用.