洪躍輝，李文哲，陳棟華，薛金滿，王江海

（1.廣東江門中醫(yī)藥職業(yè)學院，廣東江門 529000；2.中山大學海洋科學學院，廣東廣州 510006）

細胞色素P450是一類分布廣泛的血紅素蛋白超家族末端單加氧酶，是生物界中最具催化多樣性的催化劑[1-2]，能使多種難降解物質轉化為可生物降解的化合物，在環(huán)境保護（如石油污染修復、化學制藥廢水的處置）和農(nóng)業(yè)等領域中具有廣闊的應用前景[3]。其中P450在環(huán)境修復方面的應用探索是近年來國際上的研究熱點之一。例如，近年來有不少學者將P450基因導入植株中，用于清除殺蟲劑、除草劑等環(huán)境污染物[4]。

雖然目前已分離鑒定出不少P450酶，但目前已知的天然P450酶對難降解物質的催化活性較低[4]。因此，在面臨環(huán)境污染物種類和數(shù)量依然不斷增加的情況下，尋找具有新催化活性的P450酶或通過基因改造來改善現(xiàn)有酶的性質具有非常重要的科學意義。目前已經(jīng)有一些對P450基因進行改造的成功例子。例如，李紅梅[5]以P450 BM-3為研究對象，從該親本酶改造出具有新催化特性的酶，并且提高了酶活性，使其應用前景變得更加廣闊。為了對P450基因進行有針對性的改造，必須對其基本性質有較深入的認識。

無色桿菌HZ01（Achromobacter sp.HZ01）是能高效降解石油烴和合成新型脂肽類表面活性劑的海洋新菌株[6-7]。Hong等[8-9]采用全基因組和轉錄組測序剖析了該細菌的遺傳背景，預測出一種P450酶在該細菌降解正構烷烴的末端氧化途徑中發(fā)揮重要作用。該研究雖然已經(jīng)獲得了無色桿菌HZ01的細胞色素P450基因序列，但該P450的性質仍未明晰。本研究通過生物信息學分析揭示該P450的基本性質，為后續(xù)基因克隆表達、基因改造以及酶的工業(yè)化生產(chǎn)等深入研究和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 序列下載

從NCBI網(wǎng)站下載無色桿菌HZ01的細胞色素P450基因序列和蛋白序列。基因序列編號為LWKV01000001.1:c1088606-1086252，蛋白序列編號為WP_111825096.1。

1.2 蛋白質理化參數(shù)分析

采用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分析菌株HZ01_P450的理化性質，包括氨基酸組成、等電點、消光系數(shù)、不穩(wěn)定指數(shù)、親水性平均系數(shù)等[10]。分析時與Alcanivoraxborkumensis SK2的P450進行比較。

1.3 開放閱讀框（open reading frame，ORF）查找

采用NCBI網(wǎng)站的ORFfinder工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找HZ01_P450基因的開放閱讀框。

1.4 系統(tǒng)進化樹分析

采用MEGA 6.06軟件對細胞色素P450序列進行系統(tǒng)進化樹分析。

1.5 親疏水性分析

使用ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）分析HZ01_P450的親疏水性特點[11]，并與Alcanivoraxborkumensis SK2的P450進行比較。

1.6 跨膜區(qū)分析

采用TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對P450進行跨膜區(qū)分析[12]。

1.7 信號肽預測

采用SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）對P450進行信號肽預測[13]，參數(shù)設置選擇神經(jīng)網(wǎng)絡法。

1.8 二級結構預測

使用SOPMA對P450進行二級結構預測[14]。

1.9 三級結構預測

使用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org）預測P450的三級結構[15]。

1.10 蛋白功能域預測

使用SMART軟件（http://smart.embl-heidelberg.de/）預測P450的功能域。

2 結果與分析

2.1 理化參數(shù)

采用ProtParam對細胞色素P450的理化性質進行分析，結果如表1所示。P450序列中亮氨酸殘基含量最高，占9.1%。與Alcanivoraxborkumensis SK2比較，菌株HZ01_P450的氨基酸殘基數(shù)目、分子量和原子總數(shù)都大于前者。AlcanivoraxborkumensisSK2是廣泛存在的一種海洋細菌，能以石油烴為唯一碳源和能源。Schneiker等[16]采用高通量測序從該細菌中鑒定出與烷烴降解相關的細胞色素P450。前期通過比較基因組分析發(fā)現(xiàn)，菌株SK2的基因組比HZ01小，且基因組較精簡[9]。菌株SK2_P450的氨基酸殘基數(shù)目、分子量和原子總數(shù)較小的原因可能與其基因組精簡性有一定關系。

表1 細胞色素P450的理化性質

從表1的理化參數(shù)結果可知，兩種P450的親水性平均系數(shù)（GRAVY）都為負數(shù)，這說明這兩種P450屬于親水性蛋白。預測等電點都小于6.50，這一數(shù)據(jù)在后續(xù)對HZ01_P450進行分離純化或電泳鑒定時，可作為一個重要的參考信息，有助于選擇合適的緩沖液。不穩(wěn)定指數(shù)（instability index）可用于評估蛋白質的穩(wěn)定性，當某種蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)小于40時，被預測為穩(wěn)定蛋白；當不穩(wěn)定指數(shù)大于40時，則該蛋白可能是不穩(wěn)定的[17]。表1顯示，兩種P450的不穩(wěn)定指數(shù)估測值分別為49.15（菌株HZ01）和40.12（菌株SK2），表明它們可能是不穩(wěn)定蛋白。這一結果提示，在后續(xù)HZ01_P450的應用中，需要考慮其不穩(wěn)定性，這一性質可作為基因改造的一個著手點。

2.2 開放閱讀框

開放閱讀框查找結果如表2所示，在HZ01_P450基因中查找到13個ORF，有6個ORF位于正鏈，ORF1最長（2355 nt/784 aa），位于＜1至2355 bp區(qū)域。

2.3 系統(tǒng)進化樹

系統(tǒng)進化樹分析結果如圖1所示，無色桿菌HZ01的細胞色素P450與木糖氧化無色桿菌（Achromobacterxylosoxidans）的P450聚在一起，為一個單獨分支，說明這兩種P450的親緣關系較近；而菌株HZ01_P450與菌株SK2_P450的親緣關系則較遠。從圖中還可以看出，與無色桿菌屬（Achromobacter）的P450聚類較近，而與其他種屬細菌的P450聚類相距較遠。

圖1 P450的系統(tǒng)進化樹

2.4 親疏水性

使用ProtScale分析了細胞色素P450的親疏水性，結果如圖2所示。圖中的橫軸表示氨基酸序列的位置，縱軸代表氨基酸的標度值（得分），標度值為負數(shù)時代表親水性，標度值為正數(shù)時表示疏水性。在HZ01_P450的氨基酸序列中，標度值小于-2.30的位置分別在第49、197、213、214、215、359、447、763位氨基酸，這些位置可能是HZ01_P450的主要親水分布區(qū)，其中第215位的精氨酸（Arg）具有最低分值（-2.667）。標度值大于2.30的位置分別在第476、477、478、581、582位氨基酸，這些位置可能是HZ01_P450的主要疏水分布區(qū)，其中第477位的絲氨酸（Ser）具有最高分值（3.100）。在菌株SK2的P450序列中，第390位的精氨酸（Arg）具有最低分值（-2.956）；第302位的丙氨酸（Ala）具有最高分值（2.500）。兩種P450氨基酸序列的最低分值都出現(xiàn)在精氨酸（Arg）位置（雖然分值有微小差別）。在兩種P450序列中，有較多區(qū)域表現(xiàn)為親水性，與理化參數(shù)分析推測兩種P450都屬于親水性蛋白的結果一致。

2.5 跨膜區(qū)

蛋白跨膜區(qū)是指蛋白質序列中跨越細胞膜的區(qū)域，跨膜蛋白的疏水區(qū)往往也是其跨膜區(qū)[18]。采用TMHMM Server v.2.0進行跨膜區(qū)分析時，若整條序列被預測為“inside”或“outside”，則說明該序列不含跨膜螺旋。如圖3所示，HZ01_P450序列從頭至尾被預測為“outside”的概率值幾乎都為1，而且預測的跨膜螺旋數(shù)（TMHs）為0，表明該P450不存在跨膜區(qū)。目前在原核生物中發(fā)現(xiàn)的細胞色素P450系統(tǒng)組分都是可溶的，屬于非膜結合型蛋白[19]。根據(jù)本研究的理化參數(shù)、親疏水性和跨膜區(qū)分析結果推測，海洋新菌株HZ01的細胞色素P450是可溶的親水性非跨膜蛋白。

2.6 信號肽

采用SignalP 4.1對細胞色素P450序列進行了信號肽預測，選用的神經(jīng)網(wǎng)絡法涉及C、S、Y值，含義分別是：信號肽區(qū)域的S值較高，信號肽剪切位點處C值最高，max.Y是綜合考慮C值和S值的一個參數(shù)。如圖4的結果顯示，C、S、Y值都較低，且signal peptide參數(shù)結果為NO，說明該P450不存在信號肽。

圖3 細胞色素P450的跨膜區(qū)分析

圖4 信號肽預測分析

2.7 二級結構

使用SOPMA軟件預測了細胞色素P450的二級結構，結果如圖5所示。發(fā)現(xiàn)該P450含有4種二級結構：α螺旋（Hh），所占比例是35.08%；延伸鏈（Ee），占比15.82%；β-轉角（Tt），占比6.12%；無規(guī)卷曲（Cc），占比最高，為42.98%。

圖5 細胞色素P450的二級結構預測

2.8 三級結構

使用SWISS-MODEL對菌株HZ01_P450進行了三級結構預測，結果如圖6所示。從三級結構模型可推斷，海洋新菌株HZ01的細胞色素P450屬于球狀蛋白，主要由無規(guī)卷曲和α螺旋組成，與二級結構預測結果一致。

2.9 P450的功能域

采用SMART軟件在HZ01_P450中預測出2個功能域，結果如圖7所示。2個低復雜區(qū)域（low complexity region，LCR）分別位于氨基酸序列的2～17和574～586，長度分別為16 aa（LCR1）和13 aa（LCR2）。目前認為，LCR在蛋白質間的功能性結合等多種生物學功能中發(fā)揮關鍵作用，LCR在序列中的具體位置可能與其結合性質和生物學作用密切相關[20]。

圖6 細胞色素P450的三級結構

圖7 細胞色素P450的功能域

3 結論

本研究通過生物信息學分析首次剖析了無色桿菌HZ01細胞色素P450的基本性質。分析結果主要表明：（1）P450基因中最長的ORF長度為2355 nt；（2）HZ01_P450與木糖氧化無色桿菌的P450親緣關系較近；（3）在P450序列中有較多區(qū)域表現(xiàn)出親水性，且序列中不存在信號肽；（4）該P450可能是可溶性非跨膜蛋白，二級結構中無規(guī)卷曲所占比例最高，三級結構分析結果可推斷HZ01_P450屬于球狀蛋白；（5）SMART軟件預測出該P450含有2個低復雜區(qū)域。這些結果為無色桿菌HZ01_P450的應用（如環(huán)境修復等）奠定了基礎，有助于后續(xù)進行基因改造、酶的工業(yè)化生產(chǎn)等更深入的研究。