(湖南福來格生物技術(shù)有限公司，湖南 長沙 422010)

D-氨基酸脫氫酶(D-amino acid dehydrogenase，DAADH)屬于氧化還原酶類，是一種細(xì)菌膜蛋白，能以NADH或NADPH為輔酶可逆的催化D-氨基酸氧化成相應(yīng)的亞氨基酸，再水解為酮酸和氨[1-2]。DAADH廣泛存在于芽孢桿菌屬、鏈球菌屬等微生物體內(nèi)。1985年，Ohshima[3]在球形芽孢桿菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)了氨基酸脫氫酶。隨著研究的不斷深入，來自枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、嗜鹽鏈球菌不同來源的氨基酸脫氫酶陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。DAADH在制藥工業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[4-5]，還被應(yīng)用于生物傳感器的設(shè)計，可檢測溶液中尤其是血清中某些游離D-氨基酸的含量[6]，DAADH也被用于工業(yè)氨基酸的合成[7]。由于DAADH具有立體特異性[8]，可將它們用于合成光學(xué)純的食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的D-氨基酸。人工合成的D-氨基酸[9]除了具有天然氨基酸的大部分功能外，還具有天然氨基酸所不具備的優(yōu)良性能，在藥物合成(醫(yī)藥和農(nóng)藥)、食品、化妝品等方面具有特殊用途[10]。

本實驗室篩選到能高表達(dá)DAADH的大腸桿菌和畢赤酵母。大腸桿菌的細(xì)胞壁含有D-氨基酸，DAADH會分解D-氨基酸，從而使大腸桿菌破胞，導(dǎo)致清液酶活升高，不利于下游提取純化，也限制了細(xì)胞內(nèi)酶活提升，但大腸桿菌發(fā)酵時間短。畢赤酵母屬于真菌，真菌細(xì)胞壁中不含D-氨基酸，DAADH不會使畢赤酵母產(chǎn)生破胞問題，但發(fā)酵時間長。筆者旨在通過對大腸桿菌產(chǎn)DAADH和畢赤酵母產(chǎn)DAADH的發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化，為工業(yè)生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌 種

大腸桿菌BL21(DE3)、畢赤酵母X-33，由本實驗室構(gòu)建并保藏。

1.2 培養(yǎng)基

大腸桿菌搖瓶培養(yǎng)基：5 g/L酵母粉，10 g/L蛋白胨,10 g/L氯化鈉。

大腸桿菌發(fā)酵罐培養(yǎng)基：10 g/L甘油，10 g/L酵母粉，7.5 g/L蛋白胨，7.5 g/L磷酸氫二鉀，7.5 g/L磷酸二氫鉀，2 g/L檸檬酸，10 g/L硫酸銨, 10 g/L氯化鈉，0.5 g/L七水硫酸鎂, 1 mL/L微量元素，初始pH 7.0。

酵母搖瓶培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基，10 g/L酵母粉，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖。

酵母發(fā)酵罐培養(yǎng)基：15 g/L硫酸鎂，2.5 g/L硫酸鈣，1.5 g/L NaCl，50 g/L甘油，6 g/L KOH，10 mL/L磷酸，3 mL/L微量元素，1.0 mL/L生物素。初始發(fā)酵pH 5.0。

1.3 控制工藝

1.3.1 大腸桿菌發(fā)酵工藝控制

發(fā)酵液3.0 L，初始空氣流量200 L/h，罐體壓力0.015 MPa左右，轉(zhuǎn)速200 r/min，根據(jù)溶氧值將攪拌轉(zhuǎn)速升至800 r/min，轉(zhuǎn)速調(diào)滿后增加空氣流量至350～400 L/h，調(diào)整罐壓為0.05 MPa。氨水控制pH 7.0，溶氧反彈后補加濃度為700 g/L的葡萄糖，誘導(dǎo)前比生長速率控制在0.2～0.3，OD600達(dá)到40左右緩慢降溫誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后比生長速率控制在0.1～0.2，逐步降低，直至45 h放罐。

1.3.2 酵母發(fā)酵工藝控制

發(fā)酵液2.5 L，初始空氣流量200 L/h，罐體壓力0.015 MPa左右，轉(zhuǎn)速200 r/min，溶氧串級至800 r/min，轉(zhuǎn)速調(diào)滿后增加空氣流量至350～400 L/h，調(diào)整罐壓為0.05 MPa。溶氧反彈后補加甘油，甘油補加6～7 h后，控制罐內(nèi)溶氧為30%左右，保持2 h，再單獨補加甲醇。補加甲醇采用反向關(guān)聯(lián)補料，即溶氧高于30%即補料，溶氧穩(wěn)定30%左右，發(fā)酵時間為114 h。

1.4 檢測方法

1.4.1 發(fā)酵液OD600值檢測

取一定量發(fā)酵液，稀釋適當(dāng)倍數(shù)(保證讀數(shù)在0.2～0.8)，以去離子水為對照，測定OD600的吸光值。

1.4.2 DAADH酶活檢測

DAADH酶活包括混液酶活和清液酶活?；煲好富钪妇鶆蛉〉陌l(fā)酵液的酶活，其中包括菌體；清液酶活是發(fā)酵液離心后的上清液酶活。由于DAADH的提取工藝是離心收集菌體后破碎提取，因此上清液酶活越低越好。在一定反應(yīng)條件下，單位酶量每分鐘消耗1 μmol的NADPH為一個單位。25 ℃液態(tài)酶活力計算公式為

式中：ΔA表示每分鐘吸光度的變化值，即為斜率；S表示NADPH的摩爾消光系數(shù)，通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線求得；Vt表示反應(yīng)液的總體積，mL；Vs表示樣品酶液的體積，mL；X表示樣品酶液的稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

微生物的發(fā)酵工藝會影響工程菌的重組蛋白表達(dá)量，對產(chǎn)酶影響較大。在工程菌構(gòu)建完成后，外源蛋白的表達(dá)量往往達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)所要求的水平，因此需要對其發(fā)酵工藝進行優(yōu)化[11]。微生物發(fā)酵過程的機理復(fù)雜，并受到微生物內(nèi)部代謝調(diào)控機制和外界環(huán)境(例如培養(yǎng)基組成與配比、發(fā)酵溫度和pH)等因素的影響。對于工程菌來說，菌種對質(zhì)粒的穩(wěn)定性要求則更加嚴(yán)苛。利用工程菌進行高密度發(fā)酵，它的生長和外源蛋白的表達(dá)水平與目的蛋白本身及其遺傳特性有很大關(guān)系(如外源基因拷貝數(shù))。

本實驗室使用的發(fā)酵培養(yǎng)基配方能滿足菌種的生長和產(chǎn)酶需要，因此主要從產(chǎn)酶的誘導(dǎo)條件入手進行優(yōu)化。

2.1 大腸桿菌產(chǎn)DAADH發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.1.1 大腸桿菌產(chǎn)DAADH誘導(dǎo)溫度優(yōu)化

微生物生長和產(chǎn)酶過程中對溫度比較敏感，溫度會影響微生物代謝過程中相關(guān)酶的活性。微生物生長最適溫度與誘導(dǎo)最適溫度往往不同，一般采用前期高溫培養(yǎng)，后期低溫誘導(dǎo)策略[12]。一定范圍內(nèi)，高溫能加快菌體生長代謝，縮短培養(yǎng)時間，但隨著溫度升高，酶活下降，菌體容易衰老，蛋白表達(dá)量降低。適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)溫度還可以有效地減少包涵體的產(chǎn)生[13]。

分別選取22，25，28，32 ℃ 4個溫度進行實驗。誘導(dǎo)溫度對大腸桿菌產(chǎn)DAADH的影響如圖1所示。

圖1 誘導(dǎo)溫度對大腸桿菌產(chǎn)DAADH的影響Fig.1 Effect of induction temperature on DAADH production by Escherichia coli

由圖1可知：在32 ℃條件下，前期還可以正常產(chǎn)酶，29 h后酶活增長速度趨于平緩。理論上溫度高，會有利于微生物代謝，但合成目的蛋白質(zhì)時，速度過快會造成蛋白折疊異常，從而沒有活性，所以高溫度往往不利于產(chǎn)酶。22，25，28 ℃ 3個溫度產(chǎn)酶趨勢比較一致，隨著發(fā)酵進行，酶活逐漸增加，發(fā)酵后期的增長速度放慢。25 ℃會更有優(yōu)勢，45 h放罐酶活達(dá)到了64 U/mL。

2.1.2 大腸桿菌產(chǎn)DAADH誘導(dǎo)pH優(yōu)化

發(fā)酵過程中隨著微生物代謝進行，發(fā)酵液pH值會隨之改變[14]。大腸桿菌碳源分解代謝主要經(jīng)過檸檬酸循環(huán)，代謝產(chǎn)物大部分為有機酸，會使發(fā)酵液pH值降低，因此需要加堿來維持pH值恒定。本實驗用氨水來調(diào)節(jié)pH值，分別選定pH 6.0，6.5，7.0，7.5 這4個條件進行試驗，誘導(dǎo)pH對大腸桿菌產(chǎn)DAADH的影響如圖2所示。

圖2 誘導(dǎo)pH對大腸桿菌產(chǎn)DAADH的影響Fig.2 Effect of induced pH on DAADH production by Escherichia coli

由圖2可知：當(dāng)pH為6.5時，酶活為74.0 U/mL，比其他3個pH條件下的酶活高，而pH為7.5時則最低，放罐酶活只有52.0 U/mL，比pH為6.5時低了30%。

2.1.3 誘導(dǎo)大腸桿菌產(chǎn)DAADH起始OD600優(yōu)化

對數(shù)生長期的微生物活力較高，環(huán)境適應(yīng)能力較強，對重組大腸桿菌進行誘導(dǎo)一般選在這一時期[15]。實驗分別選取誘導(dǎo)OD600值為30，35，40，45，起始誘導(dǎo)OD600對大腸桿菌產(chǎn)DAADH的影響如圖3所示。

圖3 起始誘導(dǎo)OD600對大腸桿菌產(chǎn)DAADH的影響Fig.3 Effect of induced initial OD600 on DAADH production by Escherichia coli

由圖3可知：當(dāng)誘導(dǎo)OD600為35時，酶活最高，達(dá)到了85.0 U/mL，比OD600為30，40，45時分別高了13.0%，10.6%，14.1%。結(jié)合實驗和生產(chǎn)情況來看，由于種子、接種量以及罐子的差異，大腸桿菌生長狀況并不完全相同，因此誘導(dǎo)OD600的值只是一個范圍。根據(jù)實驗結(jié)果，誘導(dǎo)OD600的值為35左右為最佳。

2.1.4 大腸桿菌產(chǎn)DAADH發(fā)酵時間優(yōu)化

大腸桿菌的細(xì)胞壁由肽聚糖構(gòu)成，肽聚糖結(jié)構(gòu)中含有D-氨基酸，DAADH能特異性的將D-氨基酸氧化成相應(yīng)的亞氨基酸，再水解為酮酸和氨，從而裂解大腸桿菌的細(xì)胞壁，使細(xì)胞失去支撐從而破胞。酶活越高，破胞問題越嚴(yán)重，為解決這一問題，需要讓大腸桿菌在一定時間內(nèi)大量產(chǎn)酶，并在產(chǎn)酶速率放緩以后的合適時間內(nèi)放罐。

在連續(xù)監(jiān)控3批發(fā)酵的發(fā)酵液混液酶活和離心清液酶活后，以DAADH酶活為縱坐標(biāo)，以發(fā)酵時間為橫坐標(biāo)作圖，大腸桿菌產(chǎn)DAADH的發(fā)酵時間優(yōu)化如圖4所示。

圖4 大腸桿菌產(chǎn)DAADH的發(fā)酵時間優(yōu)化Fig.4 Optimization of fermentation time for DAADH production by Escherichia coli

由圖4可知：在35，38，41 h時，混液酶活分別為67.2，79.4，83.0 U/mL，離心清液酶活占發(fā)酵混液酶活的比例分別為18.6%、24%、35%。35 h清液酶活低，但混液酶活也不高，41 h混液酶活高，但清液酶活占了35%，38 h混液酶活高，清液酶活也在20%左右，因此在38 h左右放罐比較合適。

2.2 畢赤酵母產(chǎn)DAADH發(fā)酵工藝優(yōu)化

大腸桿菌細(xì)胞壁含有D-氨基酸，破胞問題勢必會存在，而且隨著酶活的提高，破胞問題也會加重，雖然提前放罐能在一定程度上緩解破胞問題帶來的負(fù)面影響，但同時也會造成資源和設(shè)備浪費，導(dǎo)致成本偏高。畢赤酵母屬于真菌，真菌細(xì)胞壁中主要成分為幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖、甘露聚糖等，這些多糖都是單糖的聚合物，不存在DAADH破壞細(xì)胞壁而導(dǎo)致細(xì)胞破裂的情況[16]。

2.2.1 畢赤酵母產(chǎn)DAADH誘導(dǎo)溫度優(yōu)化

畢赤酵母是甲醇營養(yǎng)型酵母中的一類能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源的酵母菌。它的最佳生長溫度范圍是28～30 ℃，在誘導(dǎo)產(chǎn)酶階段，在20～30 ℃范圍都可以正常產(chǎn)酶。誘導(dǎo)溫度對畢赤酵母產(chǎn)DAADH的影響如圖5所示。

圖5 誘導(dǎo)溫度對畢赤酵母產(chǎn)DAADH的影響Fig.5 Effect of induction temperature on DAADH production by Pichia pastoris

由圖5可知：畢赤酵母在誘導(dǎo)階段酶活一直呈上升趨勢，前期增速較慢，中期酶活提高迅速，后期趨于平緩。在發(fā)酵過程中，22 ℃條件下酶活比其他3個溫度條件酶活低，說明低溫不利于畢赤酵母產(chǎn)DAADH。而在28 ℃條件下，114 h放罐酶活最高，為103.7 U/mL,因此選擇誘導(dǎo)溫度為28 ℃。

2.2.2 畢赤酵母產(chǎn)DAADH誘導(dǎo)pH優(yōu)化

pH值會改變細(xì)胞膜的通透性，影響生物半透膜的正常結(jié)構(gòu)和功能，使其通透性增加，胞內(nèi)物質(zhì)流出細(xì)胞[17]，從而影響畢赤酵母的正常代謝和DAADH的合成。誘導(dǎo)pH對畢赤酵母產(chǎn)DAADH的影響如圖6所示。

圖6 誘導(dǎo)pH對畢赤酵母產(chǎn)DAADH的影響Fig.6 Effects of induced pH on DAADH production by Pichia pastoris

由圖6可知：pH 6.0的酶活為121.7 U/mL，此時酶活最高，比pH 5.0，5.5，6.5時分別高17.3%，4.9%，8.3%。

2.2.3 畢赤酵母產(chǎn)DAADH溶氧優(yōu)化

重組畢赤酵母是甲醇營養(yǎng)型工程菌，以AOX1為啟動子，當(dāng)甲醇作為唯一碳源時，畢赤酵母能被甲醇誘導(dǎo)啟動外源蛋白的表達(dá)。畢赤酵母的發(fā)酵產(chǎn)酶分為兩個階段[18]，第一階段主要是菌體生長，以甘油為碳源，第二階段以甲醇為碳源，并誘導(dǎo)AOX基因驅(qū)動外源基因表達(dá)。由于過高濃度的甘油和甲醇都會抑制畢赤酵母細(xì)胞的正常生長和產(chǎn)物的順利表達(dá)，所以需要通過合適的補料策略控制甘油和甲醇的流加，達(dá)到顯著提高外源蛋白表達(dá)量的目的。分批補料發(fā)酵模式簡單、高效，是畢赤酵母細(xì)胞高密度發(fā)酵最常用發(fā)酵模式。在甲醇誘導(dǎo)階段[19]，由于重組菌的物質(zhì)和能量代謝、比生長速率及生理狀態(tài)的改變，重組菌對碳源的需求量也會產(chǎn)生很大的改變。溶氧值對畢赤酵母產(chǎn)DAADH的影響如圖7所示。

圖7 溶氧值對畢赤酵母產(chǎn)DAADH的影響Fig.7 Effect of dissolved oxygen value on DAADH production by Pichia pastoris

由圖7可知：當(dāng)溶氧控制在10%時，前期酶活增長較快，后期酶活增長趨于平緩；當(dāng)溶氧控制在40%時，整個發(fā)酵過程中酶活都是最低的。所以甲醇加量過高過低都不利于畢赤酵母合成DAADH，甲醇濃度過高會毒害菌體，影響代謝；甲醇濃度過低會使醇氧化酶與目的蛋白減少[20]，也不利于產(chǎn)酶。當(dāng)關(guān)聯(lián)補料控制溶氧為20%時，酶活最高，達(dá)到140.5 U/mL,綜上畢赤酵母誘導(dǎo)階段溶氧控制為20%左右。

3 結(jié) 論

通過對大腸桿菌產(chǎn)DAADH誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)pH、誘導(dǎo)起始OD600值和發(fā)酵時間進行優(yōu)化，在25 ℃、pH 6.5和OD600值為35的條件下誘導(dǎo)，培養(yǎng)45 h酶活為86.0 U/mL，優(yōu)化前為64.1 U/mL，提高了34.4%。大腸桿菌細(xì)胞壁中的D-氨基酸會被DAADH分解從而導(dǎo)致細(xì)胞破裂，酶活越高，破胞現(xiàn)象越嚴(yán)重。經(jīng)過優(yōu)化確定38 h左右放罐，此時DAADH混液酶活為79.0 U/mL左右，清液酶活占20%。畢赤酵母屬于真菌，不存在DAADH破壞細(xì)胞壁而導(dǎo)致細(xì)胞破裂的情況。將連接目的基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母菌中，對畢赤酵母產(chǎn)DAADH誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)pH和溶氧值進行優(yōu)化，確定誘導(dǎo)條件為28 ℃、pH 6.0、溶氧值為20%，放罐時DAADH酶活為140.5 U/mL，比優(yōu)化前提高了58.9%。大腸桿菌和畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)DAADH，酶活都能達(dá)到較高水平。大腸桿菌發(fā)酵時間短，設(shè)備利用率高，但存在破胞問題，不利于下游酶的提?。划叧嘟湍覆淮嬖贒AADH導(dǎo)致的破胞問題，且市面上NADPH售價高，而酵母菌體中含有大量的NADPH，對需要NADPH參與循環(huán)的反應(yīng)，用酵母菌體破碎后直接參與反應(yīng)，能免去額外投加NADPH的費用，但酵母的DAADH酶活是大腸桿菌的1.8倍，發(fā)酵時間卻是大腸桿菌的2.5倍，設(shè)備利用率不高，可以根據(jù)用途選擇大腸桿菌或者畢赤酵母來進行發(fā)酵。