彭 超陳 博李 義45佟 毅45

(1.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京102209；2.營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102209；3.老年?duì)I養(yǎng)食品研究北京市工程實(shí)驗(yàn)室，北京 102209；4.中糧生物科技股份有限公司，安徽 蚌埠 233010；5.玉米深加工國家工程研究中心，吉林 長春 130033)

D-阿洛酮糖是D-果糖在C-3的差向異構(gòu)體，是自然界中存在含量極少的一種稀有單糖，具有極低的熱量值，與蔗糖甜度相似，但吸收率僅為蔗糖的0.3%，故可以替代蔗糖作為低熱甜味劑，而且研究表明D-阿洛酮糖具有多種營養(yǎng)學(xué)和生理學(xué)功能[1-3]。但是，D-阿洛酮糖的化學(xué)合成比較困難，以鉬酸鹽為催化劑，反應(yīng)溫度維持在80～120 ℃，過程副產(chǎn)物較多[4]，目前尚未有突破性進(jìn)展。生物轉(zhuǎn)化方法單一，純化步驟簡單，受到科研人員的重點(diǎn)關(guān)注，利用微生物途徑和酶催化轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)D-阿洛酮糖是目前的主流研究方向，而DPEase酶可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖之間的轉(zhuǎn)化，利用D-果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖[5-6]。

筆者以中糧營養(yǎng)健康研究院構(gòu)建的高效表達(dá)DPEase酶的工程大腸桿菌為研究對(duì)象，在5 L發(fā)酵罐中考察誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)pH和誘導(dǎo)劑用量對(duì)大腸桿菌生長和蛋白酶表達(dá)的影響，確定了大腸桿菌異源表達(dá)DPEase酶的較優(yōu)誘導(dǎo)條件，為進(jìn)一步研究D-阿洛酮糖的生物轉(zhuǎn)化提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 菌 株

工程大腸桿菌NHRI-Ec01，中糧營養(yǎng)健康研究院實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏，卡那霉素抗性。

1.2 菌種培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀9 g/L，磷酸氫二銨4 g/L，無水檸檬酸1.7 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，七水硫酸鎂0.6 g/L，維生素B1 0.004 5 g/L，消泡劑0.1 g/L，微量元素1 mL/L，25%氨水溶液調(diào)節(jié)pH至7.0±0.1。

微量元素：EDTA 0.72 g/L，六水氯化鈷0.25 g/L，四水氯化錳1.5 g/L，五水硫酸銅0.22 g/L，硼酸0.3 g/L，鉬酸銨0.182 g/L，硫酸鋅1.7 g/L，五水檸檬酸鐵銨17.58 g/L，濃硫酸1 mL，去離子水1 L。按配方配好后在超凈臺(tái)用0.22 μm無菌過濾膜過濾，裝入無菌棕色瓶避光4 ℃保存。

補(bǔ)料培養(yǎng)基：葡萄糖600 g/L，無水檸檬酸15 g/L，七水硫酸鎂2 g/L。

1.3 儀器與設(shè)備

Y-1200型可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Milli-Q超純水儀，美國密理博有限公司；ZQZY-CF8振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；1-14小型臺(tái)式離心機(jī)，Sigma；1260 infinity高效液相色譜儀，Agilent Technologies；SBA-40E生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；BioFlo 115發(fā)酵罐，New Brunswick；LX-600冷卻水循環(huán)裝置，YKKY；750-30無油空氣壓縮機(jī)，上海捷豹壓縮機(jī)制造有限公司。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 種子培養(yǎng)

工程大腸桿菌NHRI-Ec01的甘油管菌種保藏于-80 ℃冰箱內(nèi)待用。取甘油管內(nèi)200 μL菌懸液接入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃，200 r/min條件下在恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16～17 h后得一級(jí)種子液，種子液OD600達(dá)到3.0以上。

1.4.2 發(fā)酵罐發(fā)酵

新鮮種子液按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接入滅菌并冷卻后的5 L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)液的初始體積為3 L，卡那霉素抗性加至質(zhì)量終濃度為50 μg/mL。初始培養(yǎng)溫度為37 ℃，初始通氣比為1 m3/(m3·min)，25%氨水調(diào)節(jié)pH在6.8～7.2，初始糖耗盡后，采用補(bǔ)料-溶氧聯(lián)動(dòng)方式控制補(bǔ)料培養(yǎng)基流加速率，使得發(fā)酵液中殘?zhí)呛亢愣ňS持在較低水平(小于1.0 g/L)，溶氧(Dissolved oxygen,DO)與轉(zhuǎn)速級(jí)聯(lián)，并控制DO在25%左右，發(fā)酵液OD600達(dá)到一定水平后，調(diào)整發(fā)酵溫度和pH至不同水平，添加一定量的誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

1.5 檢測方法

1.5.1 菌體量測定

將發(fā)酵液按照一定倍數(shù)稀釋，直至在600 nm波長處的吸光值介于0.3～0.7，測量600 nm下的吸光值，乘以稀釋倍數(shù)即為菌體量(OD600)。

1.5.2 殘?zhí)菧y定

取新鮮均一發(fā)酵液，以12 000 r/min高速離心，收集上清液，稀釋至可檢測范圍，SBA-40E型生物傳感器進(jìn)行分析檢測。

1.5.3 DPEase酶濃度測定

安捷倫HPLC 1260化學(xué)工作站，色譜柱為waters sugar-Pak I，規(guī)格為10 μm ×6.5 mm×300 mm，示差折光檢測器RID，檢測器溫度55 ℃，進(jìn)樣量10 μL，以脫氣超純水作流動(dòng)相，流速為0.4 mL/min，柱溫為85 ℃。

樣品的測定：發(fā)酵液離心收集菌體后，無菌生理鹽水重懸至OD600值為100，60 MPa壓力下均質(zhì)機(jī)處理2～3次，細(xì)胞破碎液經(jīng)離心得到澄清酶液。新鮮酶液經(jīng)稀釋后，與30%質(zhì)量濃度的果糖葡萄糖混合液按體積比1∶20混合，55 ℃條件下反應(yīng)5 min。反應(yīng)后的樣品在100 ℃條件下高溫煮10 min以終止酶反應(yīng)。酶反應(yīng)產(chǎn)物低溫離心，上清液用0.22 μm微濾膜過濾處理，稀釋后進(jìn)行HPLC檢測。

假設(shè)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=AX+B，Y為峰面積，由液相檢測可得，A和B分別代表標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距，X為D-果糖濃度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式計(jì)算可得。平衡轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式為

式中：X1為各樣品的D-果糖濃度；X2為空白對(duì)照的果糖濃度。

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

2.1 工程大腸桿菌NHRI-Ec01的生長曲線測定

按1.4.2描述的方法進(jìn)行5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)(未誘導(dǎo)無補(bǔ)料)，每隔2～4 h取樣測定OD600，并繪制出NHRI-Ec01菌株在5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)的生長曲線如圖1所示。

圖1 工程菌在5 L發(fā)酵罐中生長曲線Fig.1 The growth curve of engineering bacteria NHRI-Ec01 in 5 L bioreactor

由圖1可知：培養(yǎng)6 h，菌體生長進(jìn)入指數(shù)期(OD600為3.59)，16 h進(jìn)入穩(wěn)定期(OD600維持在35～37)。若進(jìn)一步延長周期，菌體會(huì)因?yàn)闋I養(yǎng)缺陷而進(jìn)入衰亡期。指數(shù)生長期中期，菌體生長最為活躍，對(duì)外界環(huán)境最為敏感[7-8]，因此將指數(shù)生長期中期(6～12 h)作為NHRI-Ec01菌株的最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。

2.2 誘導(dǎo)溫度對(duì)工程菌生長和DPEase酶平衡轉(zhuǎn)化率的影響

異源蛋白的表達(dá)很大程度上會(huì)增加宿主菌株的負(fù)擔(dān)，影響自需蛋白的正常表達(dá)，蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的正確折疊才是功能蛋白的合成基礎(chǔ)。通過降溫處理，可減緩多肽合成速率，為肽鏈正確空間折疊預(yù)留充足時(shí)間，避免形成無生物活性的包涵體結(jié)構(gòu)[9-10]。本實(shí)驗(yàn)按照1.4.2描述的方法進(jìn)行5 L發(fā)酵培養(yǎng)，初始溫度固定37 ℃，從指數(shù)期中期開始，培養(yǎng)溫度分別降至30，25，20 ℃，待溫度穩(wěn)定后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)，以考察誘導(dǎo)溫度對(duì)工程菌生長和DPEase酶表達(dá)的影響。發(fā)酵結(jié)果及酶活轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)如圖2，3所示。

圖2 誘導(dǎo)溫度對(duì)工程大腸桿菌生長的影響Fig.2 Effect of induction temperature on biomass growth and DPEase conversion rate

圖3 誘導(dǎo)溫度對(duì)DPEase酶平衡轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of induction temperature on DPEase conversion rate

由圖2可知：菌種活力旺盛，接種量合理，沒有明顯的延滯期，發(fā)酵6 h生長曲線已經(jīng)達(dá)到指數(shù)中期，分別降溫至不同水平并誘導(dǎo)后，菌體生長速率不同程度受影響，其中20 ℃誘導(dǎo)后的菌體生長速度影響最小，最高菌體OD600為62，可能是因?yàn)楫愒吹鞍渍_折疊，菌體負(fù)載壓力變化不大，而繼續(xù)保持較高溫度，形成包涵體沉淀的蛋白越多(蛋白膠圖未提供)，不可溶性錯(cuò)誤蛋白的積累不利于菌體生長，誘導(dǎo)18 h后發(fā)酵結(jié)束。

由圖3可知：低溫誘導(dǎo)表達(dá)的DPEase酶平衡轉(zhuǎn)化率最高，接近24%，盡管離文獻(xiàn)報(bào)道的最大轉(zhuǎn)化率64%相差甚遠(yuǎn)[11]，但基本可以證明低溫誘導(dǎo)的優(yōu)越性。另外，低溫發(fā)酵往往會(huì)增加冷卻機(jī)組的能耗，加重企業(yè)運(yùn)行成本，而圖3同樣揭示了不同溫度誘導(dǎo)后的平衡轉(zhuǎn)化率差異不大?；诖?，該工程菌的最佳誘導(dǎo)溫度可以因季節(jié)和區(qū)域的不同，選定20～30 ℃比較適宜。

2.3 pH對(duì)工程菌生長和DPEase酶平衡轉(zhuǎn)化率的影響

蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)同樣受外界環(huán)境pH的影響。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確翻譯的氨基酸序列，序列中酸性氨基酸和堿性氨基酸的數(shù)量不同，影響到肽鏈或者蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)；同時(shí)，維持蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵和靜電作用也受環(huán)境pH的影響[12-13]。本實(shí)驗(yàn)按照1.4.2描述的方法進(jìn)行5 L發(fā)酵培養(yǎng)，初始pH 7.0，培養(yǎng)至指數(shù)中期后降溫至25 ℃，并分別調(diào)整pH為6.6，7.0，7.4，待溫度和pH穩(wěn)定后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)長超過18 h，以考察不同誘導(dǎo)pH對(duì)工程菌生長和DPEase酶表達(dá)的影響。發(fā)酵結(jié)果及酶活轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)如圖4，5所示。

圖4 誘導(dǎo)pH對(duì)工程菌生長的影響Fig.4 Effect of induction pH level on biomass growth

圖5 誘導(dǎo)pH對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)相應(yīng)DPEase酶的平衡轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of induction pH level on DPEase conversion rate at different time

圖4，5分別了揭示了誘導(dǎo)pH對(duì)該工程菌生長和DPEase酶活性的影響。由圖4，5可知：誘導(dǎo)之前，發(fā)酵罐之間的生長平行性良好，降溫調(diào)pH后，相對(duì)來說，堿性環(huán)境對(duì)生長的影響較為明顯，穩(wěn)定平臺(tái)期的生物量比其他兩組低16%～19%，推斷是過量氨水中和了中間代謝有機(jī)酸，對(duì)有機(jī)酸的傳遞與供應(yīng)產(chǎn)生了競爭抑制?？刂苝H為6.6時(shí)，發(fā)酵穩(wěn)定平臺(tái)期的OD600比pH 7.0方案稍高，說明該改造菌株適應(yīng)于中性和偏酸性環(huán)境，與文獻(xiàn)報(bào)道的工程大腸桿菌異源表達(dá)類人膠原蛋白生長最適pH接近[14]。

對(duì)于DPEase酶的表達(dá)，發(fā)酵終點(diǎn)DPEase酶的平衡轉(zhuǎn)化率受pH影響變化不大，均在28%左右，但是相對(duì)于其他2組，pH 7.0恒定方案在發(fā)酵周期控制上有明顯優(yōu)勢，在誘導(dǎo)12 h、發(fā)酵18 h就可以達(dá)到最高的平衡轉(zhuǎn)化率，發(fā)酵周期壓縮25%，恒定pH亦不會(huì)額外增加酸堿用量。因此，選擇pH 7.0作為誘導(dǎo)pH。

2.4 誘導(dǎo)劑用量對(duì)工程菌的生長和DPEase酶表達(dá)的影響

Lac操縱子來源的啟動(dòng)子經(jīng)常被用于原核表達(dá)系統(tǒng)(如大腸桿菌)的啟動(dòng)表達(dá)，乳糖及類似物作為誘導(dǎo)劑，IPTG被認(rèn)為是一種高效的非代謝性分子生物學(xué)誘導(dǎo)劑，但I(xiàn)PTG價(jià)格昂貴，誘導(dǎo)劑成本往往成為最大的原料成本[15]，甚至可以決定一個(gè)工程菌產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目的利潤率高低，因此合適的誘導(dǎo)劑用量，即可以保證異源蛋白的有效表達(dá)，又可以避免高價(jià)IPTG的浪費(fèi)。

本實(shí)驗(yàn)按照1.4.2描述的方法進(jìn)行5 L發(fā)酵培養(yǎng)，初始pH7.0，培養(yǎng)至指數(shù)中期后降溫至25 ℃，并維持pH為7.0，待溫度和pH穩(wěn)定后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)劑的終濃度分別為0.2，0.5，1.0 mmol/L。誘導(dǎo)時(shí)長18 h，以考察不同誘導(dǎo)劑用量對(duì)工程菌生長和DPEase酶表達(dá)的影響。發(fā)酵結(jié)果及酶活轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)如圖6，7所示。

圖6 誘導(dǎo)劑用量對(duì)工程大腸桿菌生長的影響Fig.6 Effect of terminal concentration of IPTG on biomass growth

圖7 誘導(dǎo)劑用量對(duì)DPEase酶平衡轉(zhuǎn)化率的影響Fig.7 Effect of terminal concentration of IPTG on DPEase conversion rate

由圖6，7可知：誘導(dǎo)劑的影響非常顯著，其中圖6比較了誘導(dǎo)前后的生長趨勢，圖7顯示最適誘導(dǎo)劑濃度為0.5 mmol/L。IPTG作為一種強(qiáng)效誘導(dǎo)劑，對(duì)菌體具有一定的毒性，瞬間的濃度過高，導(dǎo)致異源蛋白非正常折疊的概率增加，非可溶性蛋白進(jìn)一步增加了菌體的生長負(fù)擔(dān)，發(fā)酵中后期菌株逐漸適應(yīng)，表現(xiàn)出輕微增長，低濃度的誘導(dǎo)劑收獲最高的生物量。對(duì)于DPEase酶的平衡轉(zhuǎn)化率，IPTG的終濃度符合0.1～1.0 mmol/L的經(jīng)驗(yàn)范圍[16]，且在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，平衡轉(zhuǎn)化率先增后降，IPTG終濃度為0.5 mmol/L時(shí)對(duì)應(yīng)的平衡轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到27.6%。

3 結(jié) 論

對(duì)基因工程菌株進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)的目的在于提高目的蛋白的表達(dá)產(chǎn)量，降低成本。目的基因的表達(dá)量，除了受菌株自身因素和質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響外，還受誘導(dǎo)工藝的影響，因此探索一套最優(yōu)的誘導(dǎo)工藝至關(guān)重要[17]。本研究系統(tǒng)考察了工程大腸桿菌NHRI-Ec01誘導(dǎo)表達(dá)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的最優(yōu)條件，經(jīng)驗(yàn)證，生長初期溫度為37 ℃，指數(shù)中期(6 h)開始降溫至25 ℃，pH恒定7.0，待溫度和pH穩(wěn)定后，一次性加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)時(shí)長18 h，該工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)DPEase酶的平衡轉(zhuǎn)化率可達(dá)到28%，達(dá)到已公開報(bào)道的平均水平[5]。該誘導(dǎo)工藝同時(shí)兼顧能耗成本和發(fā)酵周期，為項(xiàng)目的下游工藝探索和提升提供了一定的參考依據(jù)。