李悅明，李 霞，徐洪清2，徐建春，逄瑞蓮3，張?jiān)迄i，徐炳政

(1.青島瑯琊臺(tái)集團(tuán)股份有限公司，山東 青島 266400；2.青島西海岸新區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 青島 266400；3.青島西海岸新區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局，山東 青島 266400)

白酒糟是白酒生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢渣或副產(chǎn)物，其處理利用已經(jīng)成為行業(yè)工作的重點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)酒糟年產(chǎn)2 700萬(wàn)噸，如果處理不及時(shí)，便會(huì)造成環(huán)境污染[1-2]，白酒糟中含有一定量的蛋白質(zhì)、還原糖、維生素及淀粉等成分，如能加以利用，則是一種很好的原料[3-4]。裂殖壺藻是一種單細(xì)胞海洋真菌[5]，裂殖壺藻粉是裂殖壺藻經(jīng)噴霧干燥后的一種餌料資源，其細(xì)胞內(nèi)含有大量的有活性物質(zhì)，如油脂DHA、蛋白等，保證飼料中DHA含量可以提高水產(chǎn)動(dòng)物的忍耐力，提高存活率促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育，改善免疫作用[6-8]。兩者都是優(yōu)良的飼料原料，但是蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)偏低，本試驗(yàn)通過(guò)混合兩種發(fā)酵原料，經(jīng)微生物作用后，提高原料的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，同時(shí)改變傳統(tǒng)酒糟發(fā)酵無(wú)DHA的特點(diǎn)，改善飼料產(chǎn)品品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黑曲霉菌種、產(chǎn)朊假絲酵母菌種(實(shí)驗(yàn)室保存)、白酒糟、裂殖壺藻粉，青島瑯琊臺(tái)集團(tuán)；自動(dòng)定氮儀KDN-103F，上海纖檢儀器有限公司；電子天平CP213，奧豪斯儀器有限公司。

1.2 粗蛋白的測(cè)定

利用自動(dòng)定氮儀KDN-103F，采用凱氏定氮法，測(cè)定粗蛋白含量[9]。

1.3 硝酸銨的定性檢測(cè)

加6～8滴上清液到點(diǎn)滴板上，然后加2～3滴二苯胺，觀察顏色變化結(jié)果，陽(yáng)性反應(yīng)的結(jié)果：在點(diǎn)滴板中間是深藍(lán)色，最低檢測(cè)線是0.05%[10]。

1.4 微生物混合原料發(fā)酵試驗(yàn)

將白酒糟烘干粉碎后和裂殖壺藻粉按m(白酒糟)∶m(裂殖壺藻)=1∶1.5混合后制備發(fā)酵原料，將此原料進(jìn)行不同的發(fā)酵條件的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.1 微生物不同混合比實(shí)驗(yàn)

在其他發(fā)酵條件相同的條件下，將黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母分別按m(黑曲霉)∶m(產(chǎn)朊假絲酵母)=0.6∶1，0.8∶1，1∶1，1∶1.2的比例在添加總量相同的條件下測(cè)定產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4.2 微生物接種量試驗(yàn)

在其他發(fā)酵條件相同的條件下，分別按接種量2%，3%，4%，5%，6%的比例添加混合菌種測(cè)定產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4.3 硝酸銨添加量試驗(yàn)

在其他發(fā)酵條件相同的條件下，將硝酸銨分別按質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%，0.1%，0.15%，0.2%，0.25%添加到發(fā)酵原料中后測(cè)定產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4.4 培養(yǎng)基水分試驗(yàn)

在其他發(fā)酵條件相同的條件下，將水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別調(diào)整到34%，36%，38%，40%，42%，測(cè)定產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4.5 pH試驗(yàn)

在其他發(fā)酵條件相同的條件下，將pH分別調(diào)整到4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，測(cè)定產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4.6 麩皮添加量試驗(yàn)

在其他發(fā)酵條件相同的條件下，將麩皮分別按質(zhì)量比5%，10%，15%，20%，25%的比例添加到發(fā)酵原料中發(fā)酵后測(cè)定產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4.7 溫度作用試驗(yàn)

在其他發(fā)酵條件相同的條件下，將混合好的發(fā)酵原料分別在26，28，30，32，34 ℃發(fā)酵后測(cè)定粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4.8 發(fā)酵作用時(shí)間實(shí)驗(yàn)

在其他發(fā)酵條件相同的條件下，分別控制發(fā)酵時(shí)間在48，60，72，84 h測(cè)定發(fā)酵蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4.9 最優(yōu)條件發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

取上述單因素實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)條件，進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，對(duì)比發(fā)酵前后粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化。

2 結(jié)果分析

2.1 微生物質(zhì)量比對(duì)粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

菌種質(zhì)量比對(duì)粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響如圖1所示。

圖1 菌種質(zhì)量比對(duì)粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.1 Effect of strain ration on the crude protein mass fraction

由圖1可知：不同的菌種比例對(duì)粗蛋白的影響較大，原因與黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母所分泌的酶系或菌體本身的蛋白有關(guān)，黑曲霉能分泌蛋白酶和纖維素酶，產(chǎn)朊假絲酵母含有較高的蛋白[11]，菌種之間進(jìn)行合理配比能夠提高發(fā)酵原料的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，兩者按1∶1進(jìn)行配比發(fā)酵粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。

2.2 接種量對(duì)粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

接種量對(duì)粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響如圖2所示。

圖2 接種量對(duì)粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on crude protein mass fraction

由圖2可知：當(dāng)接種量在5%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)品的粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，過(guò)低菌株增長(zhǎng)緩慢，周期長(zhǎng)，過(guò)高則使菌種生長(zhǎng)過(guò)快，不利于粗蛋白積累，而且菌種的制備也較繁瑣，增加接種量會(huì)造成成本增加，因此本實(shí)驗(yàn)的接種量控制在5%。

2.3 硝酸銨添加量對(duì)粗蛋白的影響

硝酸銨添加量對(duì)粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響如圖3所示。

圖3 硝酸銨添加量對(duì)粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.3 Effect of ammonium nitrate on the crude protein mass fraction

由圖3可知：隨著硝酸銨用量的添加，粗蛋白呈遞增趨勢(shì)，但是在硝酸銨添加量在2%時(shí)，經(jīng)硝酸鹽定性檢測(cè)，在點(diǎn)滴板中間已開(kāi)始出現(xiàn)藍(lán)色顏色反應(yīng)，代表硝酸銨添加過(guò)量，而當(dāng)硝酸銨添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.5%時(shí)，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)與2%時(shí)差別不大，且經(jīng)硝酸銨定性檢測(cè)，無(wú)顏色反應(yīng)，因此選擇硝酸銨添加量為1.5%。

2.4 培養(yǎng)基水分對(duì)粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響如圖4所示。

圖4 水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.4 Effect of water content on the crude protein mass fraction

由圖4可知：控制培養(yǎng)基含水量在42%時(shí)，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。在培養(yǎng)基含水量較低時(shí)，不適宜菌體生長(zhǎng)，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低。當(dāng)培養(yǎng)基水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高時(shí)，整個(gè)發(fā)酵基質(zhì)呈現(xiàn)黏著狀態(tài)，阻礙菌體的生長(zhǎng)?？刂婆囵B(yǎng)基水分對(duì)微生物來(lái)說(shuō)是至關(guān)重要的，本實(shí)驗(yàn)選擇水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)控制在42%。

2.5 pH對(duì)粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

pH對(duì)粗蛋白的影響如圖5所示。

圖5 pH值對(duì)粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.5 Effect of pH on the crude protein mass fraction

由圖5可知：發(fā)酵培養(yǎng)基pH在6.0～6.5時(shí)，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。菌種生長(zhǎng)都有最適合的pH，而且隨著發(fā)酵的進(jìn)行，體系的pH值會(huì)發(fā)生變化，因此需要調(diào)整培養(yǎng)基的pH，使菌體達(dá)到較為適宜的發(fā)酵。

2.6 麩皮添加量對(duì)粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

麩皮添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響如圖6所示。

圖6 麩皮添加量對(duì)粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.6 Effect of bran amount on the crude protein mass fraction

由圖6可知：麩皮添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)在15%時(shí)，原料發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，麩皮含量過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，這是因?yàn)辂熎ぶ泻休^多的碳源能促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，同時(shí)適量的麩皮的添加可以改善白酒糟的通氣性以保障微生物生長(zhǎng)所需要的氧氣[12-13]，但是過(guò)量的麩皮會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)，所以選擇麩皮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時(shí)對(duì)發(fā)酵蛋白質(zhì)的提高效果最明顯。

2.7 溫度對(duì)粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

溫度對(duì)粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響如圖7所示。

圖7 溫度對(duì)粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.7 Effect of temperature on the crude protein mass fraction

由圖7可知：在30 ℃條件下，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。當(dāng)發(fā)酵溫度較低時(shí)，微生物沒(méi)有達(dá)到最適合的生長(zhǎng)條件，生長(zhǎng)遲緩，而當(dāng)發(fā)酵溫度過(guò)高時(shí)，則可能導(dǎo)致微生物死亡或者微生物生長(zhǎng)過(guò)快，到達(dá)峰值后迅速進(jìn)入衰亡，因此粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低。

2.8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響如圖8所示。

圖8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.8 Effect of fermentation time on the crude protein mass fraction

由圖8可知：隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸提高。在前期菌種需要一定的生長(zhǎng)停滯期，在72 h隨著菌絲生長(zhǎng)及各種酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高，時(shí)間再延長(zhǎng)，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)已提高不大，因此選擇發(fā)酵時(shí)間72 h 。

2.9 最優(yōu)條件下粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

發(fā)酵前后粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為21.46%和27.63%。在控制以上單因素最優(yōu)條件下進(jìn)行發(fā)酵，此時(shí)微生物生長(zhǎng)繁殖最為旺盛，代謝產(chǎn)物積累量最大，原料的粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高最多。

3 結(jié) 論

經(jīng)黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵白酒糟和裂殖壺藻粉后可以改善產(chǎn)品質(zhì)量。發(fā)酵控制條件為在白酒糟和裂殖壺藻粉按m(白酒糟)∶m(裂殖壺藻)=1∶1.5混合后，微生物按m(黑曲霉)∶m(產(chǎn)朊假絲酵母)=1∶1，接種量5%，硝酸銨添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)42%，pH 6.0～6.5，30 ℃，麩皮添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%，發(fā)酵時(shí)間72 h的條件下組合進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，此時(shí)粗蛋白提高率為28.75%。