李學(xué)朋1，白紅兵，韓 楊

(1.內(nèi)蒙古阜豐生物科技有限公司，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010030；2.齊齊哈爾龍江阜豐生物科技有限公司，黑龍江 齊齊哈爾 161031)

L-賴氨酸作為人體第一氨基酸，具有重要生理功能，且應(yīng)用廣泛。我國賴氨酸年產(chǎn)量達(dá)193萬噸，產(chǎn)品90%用于飼料養(yǎng)殖業(yè)[1-2]。目前工業(yè)生產(chǎn)L-賴氨酸的主要方法是發(fā)酵法，通過此方法生產(chǎn)賴氨酸的微生物主要有三種，分別是谷氨酸棒狀桿菌、黃色短桿菌、大腸桿菌[3]。國內(nèi)工業(yè)生產(chǎn)中L-賴氨酸產(chǎn)酸率已經(jīng)達(dá)到220～240 g/L，轉(zhuǎn)化率在69%以上，提取收率在92%以上，生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)達(dá)到國際領(lǐng)先水平，賴氨酸產(chǎn)量居世界第一。但是培養(yǎng)基的成本直接影響著企業(yè)的發(fā)展，培養(yǎng)基原料成本升高，可直接導(dǎo)致企業(yè)利潤降低。由于玉米漿價(jià)格低，來源途徑廣，可利用其發(fā)酵氨基酸，可以提高生物價(jià)值，實(shí)現(xiàn)降低生產(chǎn)成本、增加生產(chǎn)利潤的目標(biāo)。玉米漿中含有豐富的糖類、多肽、可溶性蛋白質(zhì)、游離氨基酸等有機(jī)物，是利用微生物發(fā)酵氨基酸的優(yōu)質(zhì)原料[4-7]。

響應(yīng)面法是發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化常用的設(shè)計(jì)方法[8-11]，是降低研發(fā)成本、改良加工條件、提高產(chǎn)品質(zhì)量、解決工業(yè)生產(chǎn)問題的一種高效方法，這種方法已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于生物、食品、化學(xué)等多種領(lǐng)域[12]。本單因素試驗(yàn)運(yùn)用Design experts 8.0.6軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)回歸分析，并通過響應(yīng)面方法利用Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)研究L-賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基成分，為提高L-賴氨酸產(chǎn)量優(yōu)化培養(yǎng)基，最終降低工業(yè)生產(chǎn)成本提高效益。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

大腸桿菌FF210，由本研究室保存。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

K2SO4、磷酸、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O 、(NH4)2SO4、VB1、生物素，購自天津市北辰方正試劑廠；葡萄糖、玉米漿，由齊齊哈爾龍江阜豐生物科技有限公司提供。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

紫外分光光度計(jì)L9型，日本島津株式會(huì)社；恒溫?fù)u床SL-5000，中國上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；生物傳感器分析儀SBA-40X，山東省科學(xué)院研究所。

1.1.4 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：蔗糖50 g/L，玉米漿30 g/L，(NH4)2SO44 g/L，磷酸 1.86 g/L，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06%的硫酸鉀，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，CuSO4·5H2O 0.000 5 g/L，VB1 0.01 g/L，生物素0.002 g/L，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，玉米漿10 g/L，磷酸 1.26 g/L，(NH4)2SO420 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，CuSO4·5H2O 0.001 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 培養(yǎng)方法

取一環(huán)活化后的菌株接入到裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在30 ℃，200 r/min條件下，振蕩培養(yǎng)24 h。第一次培養(yǎng)完成后取5 mL培養(yǎng)液接種到裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，在30 ℃，200 r/min條件下，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)48 h。上步驟完成后將發(fā)酵液在8 000 r/min條件下離心10 min，離心完成后利用分析儀測(cè)定上清液中L-賴氨酸含量。每組相同發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)置3個(gè)重復(fù)，測(cè)定含量取平均值[13]。

1.3 L-賴氨酸含量測(cè)定

采用生物傳感器分析儀。原理：采用特殊設(shè)計(jì)的賴氨酸氧化酶膜電化學(xué)傳感器對(duì)賴氨酸濃度進(jìn)行檢測(cè)。儀器自動(dòng)采集樣本并導(dǎo)入至測(cè)試區(qū)域。樣本中所含的賴氨酸在固化的氧化酶的催化下發(fā)生酶解反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物為酸和過氧化氫。通過電極檢測(cè)過氧化氫的含量從而計(jì)算出賴氨酸含量。儀器通過對(duì)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的電壓值是衡量樣本賴氨酸濃度的尺度。未知濃度可與標(biāo)準(zhǔn)品的電壓信號(hào)相比較而獲得。每次測(cè)定完畢后，系統(tǒng)緩沖液會(huì)自動(dòng)清洗傳感器電極，清洗完成后即可進(jìn)行下一次測(cè)試。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素試驗(yàn)

1) 碳源種類。在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入30 g/L的供試碳源：葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉和玉米粉，進(jìn)行碳源種類的篩選。

2) 碳源濃度。將篩選得到的最適碳源，設(shè)置20，30，40，50，60，70 g/L 共6個(gè)質(zhì)量濃度梯度進(jìn)行篩選試驗(yàn)。

3)氮源種類。在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入20 g/L 的麩皮、豆餅粉、玉米漿、酵母浸膏、蛋白胨、牛肉膏、氯化銨和硫酸銨，進(jìn)行氮源種類的篩選。

4)有機(jī)氮源濃度。將篩選得到的最佳氮源，設(shè)置10，20，30，40，50 g/L共5個(gè)質(zhì)量濃度梯度進(jìn)行篩選試驗(yàn)。

5)無機(jī)氮源濃度。將篩選得到的最佳氮源，設(shè)置10，20，25，30，35，40 g/L共6個(gè)質(zhì)量濃度梯度進(jìn)行篩選試驗(yàn)。

1.4.2 響應(yīng)面分析方法

采用響應(yīng)面中的Box-Behnken設(shè)計(jì)分析方法。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析

采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行回歸分析，得到最優(yōu)組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源的選擇

不同碳源發(fā)酵產(chǎn)L-賴氨酸結(jié)果統(tǒng)計(jì)如圖1所示。

1—蔗糖；2—麥芽糖；3—葡萄糖；4—果糖；5—可溶性淀粉；6—玉米粉。圖1 不同碳源對(duì)L-賴氨酸產(chǎn)量的影響Fig.1 The effects of different carbon sources on the concentration of L-Lysine

由圖1可知：當(dāng)碳源為葡萄糖時(shí)，L-賴氨酸產(chǎn)酸水平最高，為69.22 g/L，顯著高于其他種類的碳源。這說明以葡萄糖作為碳源，最有利于L-賴氨酸的積累。因此選用葡萄糖作為最適碳源。

2.2 碳源濃度的選擇

不同葡萄糖濃度發(fā)酵產(chǎn)L-賴氨酸結(jié)果如圖2所示。

圖2 葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)L-賴氨酸產(chǎn)量的影響Fig.2 The effects of glucose concentration on the concentration of L-Lysine

由圖2可知：在一定葡萄糖質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(20～70 g/L)，L-賴氨酸產(chǎn)酸水平隨著添加量的增加而增加。當(dāng)葡萄糖添加量為40 g/L 時(shí)，其L-賴氨酸產(chǎn)量達(dá)到最大值，為73.68 g/L；繼續(xù)加大培養(yǎng)基中葡萄糖用量，其產(chǎn)酸水平?jīng)]有增加，高濃度的葡萄糖用量降低了L-賴氨酸產(chǎn)酸水平，可能是葡萄糖的粘度大，影響了發(fā)酵液的流動(dòng)性，從而導(dǎo)致生物量的減少?？紤]到響應(yīng)面法的濃度范圍篩選需要，選用20～50 g/L的葡萄糖用量作為發(fā)酵的適合質(zhì)量濃度。

2.3 氮源的選擇

不同氮源發(fā)酵產(chǎn)L-賴氨酸結(jié)果統(tǒng)計(jì)如圖3，4所示。

1—麩皮；2—豆粕粉；3—玉米漿；4—蛋白胨；5—酵母浸膏；6—牛肉膏。圖3 不同有機(jī)氮源對(duì)L-賴氨酸產(chǎn)量的影響Fig.3 The effects of different organic nitrogen sources on the concentration of L-Lysine

1—氯化銨；2—硫酸銨。圖4 不同無機(jī)氮源對(duì)L-賴氨酸產(chǎn)量的影響Fig.4 The effects of different inorganic nitrogen sources on the concentration of L-Lysine

由圖3，4可知：經(jīng)過篩選，在有機(jī)氮源中，玉米漿的L-賴氨酸產(chǎn)酸水平最高，L-賴氨酸產(chǎn)量為71.60 g/L，其次是麩皮、豆餅粉、蛋白胨、牛肉膏；在無機(jī)氮源中，硫酸銨的L-賴氨酸產(chǎn)酸水平高于氯化銨，L-賴氨酸產(chǎn)量為73.73 g/L。因此選用玉米漿作為本實(shí)驗(yàn)的有機(jī)氮源，硫酸銨作為無機(jī)氮源。

2.4 氮源濃度的選擇

2.4.1 有機(jī)氮源用量的選擇

玉米漿的篩選結(jié)果如圖5所示。

圖5 玉米漿質(zhì)量濃度對(duì)L-賴氨酸產(chǎn)量的影響Fig.5 The effects of corn steep liquor concentration on the concentration of L-Lysine

由圖5可知：隨著玉米漿的增加，L-賴氨酸的積累表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)玉米漿添加量達(dá)30 g/L時(shí)，L-賴氨酸產(chǎn)酸水平達(dá)到最大值，為76.85 g/L；當(dāng)玉米漿添加量超過30 g/L后，L-賴氨酸產(chǎn)酸水平開始急劇下降?？紤]到響應(yīng)面法的濃度范圍篩選需要，選擇添加20～40 g/L的玉米漿作為最優(yōu)質(zhì)量濃度。

2.4.2 無機(jī)氮源用量的選擇

硫酸銨質(zhì)量濃度對(duì)L-賴氨酸產(chǎn)量的影響如圖6所示。

圖6 硫酸銨質(zhì)量濃度對(duì)L-賴氨酸產(chǎn)量的影響Fig.6 The effects of (NH4)2SO4 concentration on the concentration of L-Lysine

由圖6可知：隨著硫酸銨濃度的增加，L-賴氨酸產(chǎn)量也會(huì)持續(xù)加大，當(dāng)硫酸銨用量達(dá)25 g/L后，L-賴氨酸產(chǎn)酸水平達(dá)到最大值，為78.24 g/L，繼續(xù)增加其用量將不會(huì)對(duì)L-賴氨酸的數(shù)值產(chǎn)生明顯的差異。為節(jié)約成本，同時(shí)考慮到響應(yīng)面法的濃度范圍篩選需要，建議選用15～40 g/L的硫酸銨質(zhì)量濃度為發(fā)酵所用。

2.5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與模型可行性分析

Box-Behnken設(shè)計(jì)影響因素水平取值如表1所示。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

通過Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理?；貧w方程式為

R=78.07+3.9A+5.29B+2.69C-0.93AB-

3.85AC+3.21BC-0.36A2-6.84B2-3.29C2

設(shè)計(jì)出的模型試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值的差異很小可應(yīng)用于指導(dǎo)試驗(yàn)，對(duì)模型進(jìn)行方差分析，如表3所示。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The Box-Behnken design and results

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regresssion model

注：P<0.05，表示差異顯著；P<0.01，表示差異極顯著；P>0.05，表示差異不顯著。

由表3可知：在此模型中A，B，C，AC，BC，B2，C2均顯著，AB，A2不顯著，3 種成分對(duì)賴氨酸產(chǎn)率影響程度依次為葡萄糖>玉米漿>硫酸銨。

玉米漿、葡萄糖、硫酸銨三者之間的交互影響L-賴氨酸得率的響應(yīng)面圖和等高線圖如圖7～9所示。

圖7 玉米漿與葡萄糖交互影響L-賴氨酸得率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour plot of effect of corn starch and glucose on L-lysine yield

圖8 玉米漿與硫酸銨交互影響L-賴氨酸得率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 Response surface plot and contour plot of effect of corn starch and (NH4)2SO4 on L-lysine yield

圖9 葡萄糖與硫酸銨交互影響L-賴氨酸得率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.9 Response surface plot and contour plot of effect of glucose and (NH4)2SO4 on L-lysine yield

由圖7～9可知：葡萄糖與硫酸銨的交互作用顯著。當(dāng)玉米漿的質(zhì)量濃度一定時(shí)，隨著培養(yǎng)基中葡萄糖與硫酸銨質(zhì)量濃度的增加，L-賴氨酸的得率先增加后降低，在葡萄糖與硫酸銨質(zhì)量濃度分別為42.95 g/L，35.72 g/L時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)L-賴氨酸得率為80.42 g/L；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度一定時(shí)，玉米漿與硫酸銨的交互作用亦顯著。隨著培養(yǎng)基中玉米漿與硫酸銨質(zhì)量濃度的增加，L-賴氨酸的得率先逐漸增加后逐漸降低，在玉米漿與硫酸銨質(zhì)量濃度分別為39.85 g/L，27.30 g/L時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)L-賴氨酸得率為81.58 g/L；當(dāng)硫酸銨的質(zhì)量濃度一定時(shí)，玉米漿與葡萄糖的交互作用不顯著。

通過軟件分析優(yōu)化得出培養(yǎng)基成分最佳質(zhì)量濃度為玉米漿36.47 g/L，葡萄糖39.76 g/L，硫酸銨30.10 g/L，在此體系下，L-賴氨酸的理想產(chǎn)率為81.35 g/L。通過3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)驗(yàn)證，得到數(shù)據(jù)分別為81.38，81.67，81.91 g/L，平均值為81.65 g/L，與系統(tǒng)模擬值基本相符，說明該Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與模型可行。

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)運(yùn)用Design Expert 8.0.6分析軟件，通過Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，確定3個(gè)主要因素物質(zhì)的添加量分別為玉米漿36.47 g/L，葡萄糖39.76 g/L，硫酸銨30.10 g/L，搖瓶實(shí)驗(yàn)理論L-賴氨酸得率為81.35 g/L。通過3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，測(cè)得L-賴氨酸質(zhì)量濃度平均值為81.65 g/L，與系統(tǒng)模擬值基本相符。此實(shí)驗(yàn)值與優(yōu)化前數(shù)值69.22 g/L相比，質(zhì)量濃度提高了17.96%。因此，采用響應(yīng)面分析法中的Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化大腸桿菌生產(chǎn)L-賴氨酸的方法是可以應(yīng)用的，通過降低培養(yǎng)基中葡萄糖的質(zhì)量濃度，使玉米漿中所含的營養(yǎng)物質(zhì)得到充分利用，為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效益奠定基礎(chǔ)。