朱 弢,鄭偉青,王 斌,林江波,金順巧,江建軍*

0 引言

血小板在冠狀動(dòng)脈疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用[1]。血小板的激活和聚集參與了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)導(dǎo)致的冠狀動(dòng)脈機(jī)械破裂之后的冠狀動(dòng)脈內(nèi)血栓增殖過(guò)程[1-2]?？寡“逯委熓枪跔顒?dòng)脈疾病的標(biāo)準(zhǔn)療法。Meta分析顯示，在接受抗血小板治療的高危冠心病患者中，嚴(yán)重血管事件的復(fù)發(fā)率降低了25%[1]。阿司匹林主要抗栓機(jī)制是乙?；“逯械沫h(huán)氧化酶-1(COX-1)，從而抑制血栓素的合成。然而，有部分患者在服用阿司匹林后未觀察到相同的抗血小板作用，反而出現(xiàn)復(fù)發(fā)性血栓栓塞，這種現(xiàn)象稱為阿司匹林抵抗(AR)。貧血、高齡、糖尿病、高三酰甘油以及高血壓是冠心病患者發(fā)生AR的危險(xiǎn)因素。然而，關(guān)于miR-146a與冠心病患者PCI術(shù)后發(fā)生AR的研究十分有限。本研究旨在探討冠心病患者血清miR-146a表達(dá)水平與PCI術(shù)后發(fā)生AR的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年11 月至2018年8月在我院心內(nèi)科接受PCI治療的冠心病患者。納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)確診為冠心病，且接受PCI 治療;②年齡≤80 歲;③無(wú)手術(shù)禁忌證;④入院前未接受阿司匹林治療。排除標(biāo)準(zhǔn):①對(duì)阿司匹林過(guò)敏者;②合并出血性疾病、血液系統(tǒng)疾病或有出血傾向者;③術(shù)前2周口服抗凝藥(如噻氯匹定、華法林、替格瑞洛等)者;④合并惡性腫瘤、心功能Ⅳ級(jí)、嚴(yán)重感染、嚴(yán)重肝腎功能損害等其他嚴(yán)重疾病者。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象在參與本研究前均已簽署知情同意書。

1.2 抗凝治療方法 PCI術(shù)后，所有患者給予口服阿司匹林(批號(hào):J20171021，拜耳醫(yī)藥保健有限公司)治療，0.1 g/次，1次/d，持續(xù)治療30 d。

1.3 AR診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)Gum定義的AR標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)滿足以下2個(gè)條件者為AR，滿足二者之一者為阿司匹林半抵抗(ASR):①用10 μmol/L二磷酸腺苷(ADP)作為誘導(dǎo)劑，測(cè)得血液中的血小板平均聚集率≥70%;②用0.5 mg/ml花生四烯酸(AA)作為誘導(dǎo)劑，測(cè)得血液中的血小板平均聚集率≥20%。AR和ASR統(tǒng)稱為AR[3]。

1.4 血清miR-146a的檢測(cè) 于術(shù)前抽取患者空腹靜脈血5 ml，3 000 r/min離心取上清液。采用Trizol試劑盒(Invitogen，Carlsbad，CA，USA)提取總RNA。所得RNA樣品的質(zhì)量經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)。凝膠顯示清晰的28 S、18 S和5 S帶，28 S帶的亮度約為18 S的2倍，表明RNA是完整的，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒產(chǎn)生cDNA。采用聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照基因，測(cè)量miR-146a的表達(dá)水平。RT-PCR條件包括35個(gè)循環(huán):95 ℃變性30 s，64 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s。每個(gè)RT-PCR實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次取平均值。采用2-△△CT法計(jì)算miR-146a相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象一般情況 本研究共納入376例患者，男267例(71.01%)，女109例(28.99%)。平均年齡(62.70±8.6)歲，63 例(16.76%)為AR患者。對(duì)患者一般資料進(jìn)行比較，AR組中吸煙、高血壓、糖尿病的構(gòu)成比顯著高于非AR組，AR組空腹血糖、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和miR-146a表達(dá)水平顯著高于非AR組，AR組高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)顯著低于非AR組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 兩組研究對(duì)象一般情況比較

2.2 血小板平均聚集率與各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析 對(duì)376例患者ADP誘導(dǎo)的血小板平均聚集率和AA誘導(dǎo)的血小板平均聚集率與其他指標(biāo)進(jìn)行Pearson直線相關(guān)分析。結(jié)果顯示，ADP誘導(dǎo)的血小板平均聚集率和AA誘導(dǎo)的血小板平均聚集率均與血糖、三酰甘油、LDL-C和miR-146a呈正相關(guān)(P<0.05)，與HDL-C呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、總膽固醇和血小板計(jì)數(shù)無(wú)關(guān)(P>0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 ROC曲線分析 當(dāng)miR-146a的cut-off值為4.17時(shí)，預(yù)測(cè)冠心病患者PCI術(shù)后發(fā)生AR的敏感度為93.2%，特異度為62.6%，曲線下面積為0.846(95%CI:0.805～0.881，P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.4 多因素Logistic回歸分析 以測(cè)冠心病患者PCI術(shù)后發(fā)生AR為因變量，以表1中兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量(吸煙、高血壓、糖尿病、血糖、三酰甘油、HDL-C、LDL-C、miR-146a)為自變量納入Logistic回歸方程，采用后退法。結(jié)果顯示,吸煙、高血壓、糖尿病、高血糖、高三酰甘油、低HDL-C、高LDL-C、高miR-146a是冠心病患者PCI術(shù)后發(fā)生AR的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1 miR-146a預(yù)測(cè)冠心病患者PCI術(shù)后發(fā)生AR的ROC曲線

3 討論

PCI是冠心病患者最常用的治療方式。PCI主要通過(guò)冠狀動(dòng)脈支架的植入從而實(shí)現(xiàn)血運(yùn)重建的目的，目前已被廣泛應(yīng)用于臨床[4]。近年研究顯示，支架本身可以激活血小板，引起支架內(nèi)血小板聚集，導(dǎo)致支架內(nèi)血栓形成，進(jìn)而嚴(yán)重危及患者的生命安全[5]。目前，阿司匹林常用于冠心病患者PCI術(shù)后抗血小板治療且效果顯著。然而在治療的過(guò)程中，部分患者血小板活性并沒(méi)有被完全抑制，會(huì)出現(xiàn)阿司匹林抵抗，從而導(dǎo)致不良的臨床效果[6-7]。本研究檢測(cè)了376例經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療冠心病患者的血小板聚集率。結(jié)果表明，AR的發(fā)生率為16.8%，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]。

表2 血小板平均聚集率與各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

表3 冠心病患者PCI術(shù)后發(fā)生AR多因素Logistic回歸分析

microRNA是短的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄水平上抑制蛋白編碼基因的表達(dá)[9]。每一個(gè)microRNA可調(diào)節(jié)幾十到數(shù)百個(gè)與功能相關(guān)的靶基因。隨著對(duì)microRNA研究的不斷深入，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，microRNA與阿司匹林抵抗有一定的相關(guān)性。范雪松等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，較低水平的尿miR-126與健康人AR發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)。王建麗[11]研究發(fā)現(xiàn)，血小板miR-200b和miR-495表達(dá)水平降低可增加急性腦梗死患者AR的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。馬開(kāi)富等[12]檢測(cè)了137例急性腦梗死患者血小板miR-19a的表達(dá)水平， 發(fā)現(xiàn)AR組患者血小板miR-19a的表達(dá)水平顯著高于非AR組患者。然而，尚沒(méi)有研究探索miR-146a與冠心病患者PCI術(shù)后發(fā)生AR的相關(guān)性。本研究納入在我院心內(nèi)科接受PCI治療的冠心病患者376例，檢測(cè)其血清miR-146a的表達(dá)水平，并分析血清miR-146a的表達(dá)水平與AR的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-146a的表達(dá)水平上調(diào)可增加冠心病患者PCI術(shù)后發(fā)生AR的風(fēng)險(xiǎn)。目前，AR的發(fā)生機(jī)制尚不清楚，有學(xué)者認(rèn)為關(guān)于其可能與非COX-1介導(dǎo)的血小板活化、藥代動(dòng)力學(xué)、血小板反應(yīng)性、藥物遺傳學(xué)等有關(guān)。王路橋等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a可能依賴血小板TLR-4信號(hào)通路，介導(dǎo)血小板免疫活化進(jìn)而促進(jìn)血小板聚集。Guo等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a可促進(jìn)Th1細(xì)胞的上調(diào)并促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)又可促進(jìn)AR的發(fā)生發(fā)展[15]。

此外，本研究采用ROC曲線計(jì)算了miR-146a對(duì)冠心病患者PCI術(shù)后發(fā)生AR的預(yù)測(cè)價(jià)值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敏感度為93.2%，特異度為62.6%，曲線下面積為0.846(95%CI:0.805～0.881，P<0.05)。進(jìn)一步證實(shí)了miR-146a對(duì)冠心病患者PCI術(shù)后發(fā)生AR具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)血清miR-146a表達(dá)水平與冠心病患者PCI術(shù)后發(fā)生AR顯著相關(guān)，miR-146a表達(dá)水平上調(diào)可增加冠心病患者PCI術(shù)后發(fā)生AR的風(fēng)險(xiǎn)。