李 強(qiáng)，鄧艷輝，韋美丹，段萍萍，吳麗瑤，陳文瑛

0 引言

華法林(Warfarin)是目前臨床一線香豆素類口服抗凝藥，但是其用藥劑量受遺傳因素和藥物相互作用等非遺傳因素影響[1-2]。藥物代謝CYP2C9與維生素K環(huán)氧化物還原酶(VKORC1)是目前公認(rèn)影響華法林給藥劑量個(gè)體差異最主要的遺傳因素[3]。與常規(guī)給藥策略相比，基因檢測(cè)指導(dǎo)華法林給藥劑量可提供更好的安全性和減少出血風(fēng)險(xiǎn)[4]。目前，針對(duì)中國(guó)人群CYP2C9*3及VKORC1基因多態(tài)性預(yù)測(cè)華法林劑量的模型，因其樣本量小未被廣泛應(yīng)用，Warfarindosing網(wǎng)站常被用于預(yù)測(cè)患者華法林劑量[1,5]。該網(wǎng)站由華盛頓醫(yī)學(xué)中心的Barnes-Jewish醫(yī)院和美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院等機(jī)構(gòu)提供支持，其研發(fā)團(tuán)隊(duì)有華法林劑量精細(xì)化協(xié)會(huì)和國(guó)際華法林遺傳藥理學(xué)協(xié)會(huì)(IWPC)的生物統(tǒng)計(jì)學(xué)家、遺傳學(xué)家、藥師和醫(yī)生構(gòu)成，其估算的華法林劑量基于1 000余例患者的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[1]。本研究為比較中國(guó)漢族基于VKORC1及CYP2C9基因多態(tài)性利用Warfarindosing網(wǎng)站預(yù)測(cè)患者華法林劑量與實(shí)際劑量的差異，以了解Warfarindosing網(wǎng)站在預(yù)測(cè)中國(guó)漢族患者服用華法林劑量的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集廣州某三甲醫(yī)院2017年7月至2018年11月所有進(jìn)行華法林基因檢測(cè)的患者相關(guān)資料，包括性別、年齡、體重、身高、合并用藥及疾病狀態(tài)、服用華法林劑量和INR等。

1.2 基因分型 采用原位雜交熒光染色DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)患者CYP2C9*3、VKORC1(-1639G>A)基因型，具體操作:①取1.5 ml Eppendorf(EP)管加入1 ml氯化銨處理液與200 μl全血樣本(EDTA抗凝)上下顛倒10 次混勻，然后室溫靜置5 min。②將樣本放入離心機(jī)中，3 000 r/min離心5 min。③去上清液后EP管底部可見約2 mm×2 mm的白細(xì)胞沉淀，若團(tuán)塊過小須重復(fù)①～③步驟。④向EP管中加入30 μl耀金保(北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司)反復(fù)吹打混勻，放于室溫靜置30 min，得到白細(xì)胞裂解液。⑤取1.5 μl白細(xì)胞裂解液加入CYP2C9*3、VKORC1分析樣品處理試劑(北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司)后，置于TL998A熒光檢測(cè)儀中檢測(cè)。⑥采用數(shù)字原位雜交熒光染色分析系統(tǒng)，自動(dòng)判讀熒光信號(hào)值，獲取熒光曲線圖，進(jìn)行CYP2C9*3、VKORC1基因分型，同時(shí)做陽性質(zhì)控，判讀各樣本基因型。記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，使用Warfarindosing網(wǎng)站計(jì)算華法林周劑量，比較華法林預(yù)測(cè)周劑量與華法林實(shí)際周劑量的差值，包括絕對(duì)差值和百分絕對(duì)差值，其中絕對(duì)差值=預(yù)測(cè)周劑量-實(shí)際周劑量;百分絕對(duì)差值=(預(yù)測(cè)周劑量-實(shí)際周劑量)/實(shí)際劑量×100%。另外，為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)其臨床實(shí)用性，計(jì)算預(yù)測(cè)劑量落在實(shí)際劑量±20%范圍內(nèi)(理想劑量)的百分比[6]。以華法林實(shí)際周劑量為縱坐標(biāo)、華法林預(yù)測(cè)周劑量為橫坐標(biāo)作散點(diǎn)圖并擬合直線，對(duì)華法林維持劑量與預(yù)測(cè)劑量進(jìn)行相關(guān)性分析，同時(shí)以擬合指數(shù)R2作為判斷模型準(zhǔn)確性的指標(biāo)，R2小于0.5提示模型準(zhǔn)確性較差。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Pearson相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性研究，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本信息 本研究共收集108例患者，血管外科106例、重癥醫(yī)學(xué)科2例，平均年齡(57.6±16.2)歲，男58例，女48例。47例服用華法林，平均年齡(54.5±14.4)歲，平均體重(63.5±11.3) kg，平均身高(163.7±8.6) cm。吸煙12例，采集到達(dá)標(biāo)INR(1.5～2.5)23例。103例患者診斷為深靜脈血栓形成，3例患者診斷為房顫，1例患者診斷為二尖瓣置換術(shù)后，1例患者診斷為雙膝人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后;各基因型的分布見表1。

表1 CYP2C9*3和VKORC1(-1639G>A)基因型的頻率分布[例(%)]

按照患者CYP2C9*3基因型不同分為AA型(*1/*1)、AC型(*1/*3)和CC型(*3/*3)，等位基因A和C的頻率分別為0.968、0.032;VKORC1(-1639G>A)基因型分為AA型、GA型和GG型，等位基因G和A的頻率分別為0.139、0.861;所有基因分布符合Hardy-weinberg遺傳平衡(P>0.05)。

2.2 預(yù)測(cè)劑量與實(shí)際劑量的符合情況 篩選檢測(cè)基因后服用華法林的病例47例，統(tǒng)計(jì)不同基因分型的預(yù)測(cè)劑量與病例數(shù)，以及實(shí)際周劑量在符合預(yù)測(cè)范圍的病例數(shù)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，對(duì)于服用華法林的47例患者，實(shí)際周劑量有38例(80.85%)在預(yù)測(cè)周劑量范圍內(nèi)，于Warfarindosing網(wǎng)站預(yù)測(cè)漢族人華法林劑量比較準(zhǔn)確，具有一定的參考意義。CYP2C9*1/*1VKORC1AA型實(shí)際周劑量在預(yù)測(cè)劑量范圍內(nèi)的比例為82.85%(29/35)，CYP2C9*1/*1VKORC1GA型實(shí)際周劑量在預(yù)測(cè)劑量范圍內(nèi)的比例為70.00%(7/10)，由于CYP2C9*1/*3VKORC1AA型和CYP2C9*1/*1VKORC1GG型病例數(shù)均為1，因此，其實(shí)際周劑量在預(yù)測(cè)劑量范圍內(nèi)的結(jié)果不納入比較。

2.3 華法林預(yù)測(cè)周劑量與維持周劑量的相關(guān)性 在院INR達(dá)標(biāo)的23例患者中，CYP2C9*1/*1VKORC1AA型患者17例，CYP2C9*1/*1VKORC1GA型患者6例。CYP2C9*1/*1VKORC1AA型和CYP2C9*1/*1VKORC1GA型預(yù)測(cè)周劑量分別為(21.37±5.15)、(31.73±8.85)mg，實(shí)際維持周劑量分別為(21.29±6.26)、(27.00±6.00)mg，CYP2C9*1/*1VKORC1AA型預(yù)測(cè)的維持周劑量與實(shí)際維持周劑量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CYP2C9*1/*1VKORC1GA型預(yù)測(cè)的維持周劑量顯著大于實(shí)際維持周劑量。比較23例患者實(shí)際維持劑量與預(yù)測(cè)劑量的平均絕對(duì)差值和百分絕對(duì)差值，結(jié)果顯示，模型對(duì)CYP2C9*1/*1VKORC1AA預(yù)測(cè)劑量百分絕對(duì)差值均最小(0.08±4.93) mg，見表2。華法林預(yù)測(cè)劑量與實(shí)際劑量存在相關(guān)性(P=0.000，r=0.748，R2=0.56)，其相關(guān)性曲線見圖1，CYP2C9*1/*1VKORC1GA型患者(R2=0.78)預(yù)測(cè)劑量與實(shí)際劑量相關(guān)性優(yōu)于CYP2C9*1/*1VKORC1AA型患者。

圖1 華法林模型預(yù)測(cè)劑量與維持劑量的相關(guān)性

3 討論

本文中入選的108 例患者中，CYP2C9*1/*1的頻率為93.52%，CYP2C9*1/*3的頻率為6.48%;VKORC1(-1639G>A)AA基因型的頻率為75.00%;與之前的文獻(xiàn)報(bào)道的突變頻率一致[7]。漢族人的基因分布CYP2C9*3主要以AA型、VKORC1(-1639G>A)AA主要以AA型、VKORC1(-1639G>A)AA型的患者對(duì)華法林敏感，所需的華法林的維持劑量較小[8]，因此，漢族人對(duì)華法林敏感，所需華法林劑量較小。

華法林的預(yù)測(cè)劑量與實(shí)際維持劑量相關(guān)系數(shù)R2值為0.56，略大于之前報(bào)道的采用IWPC模型預(yù)測(cè)漢族人群華法林劑量與實(shí)際維持劑量相關(guān)系數(shù)(R2=0.53)[9]，表明本研究對(duì)納入對(duì)象采用Warfarindosing網(wǎng)站預(yù)測(cè)患者華法林劑量準(zhǔn)確性較好，可能與該網(wǎng)站基于IWPC模型考慮患者吸煙、肝功能、目標(biāo)INR值及基礎(chǔ)INR值等有關(guān)，能更多地解釋華法林個(gè)體差異。但華法林預(yù)測(cè)劑量與實(shí)際劑量存在偏差，CYP2C9*1/*1VKORC1GA型的預(yù)測(cè)劑量明顯高于實(shí)際維持劑量(P<0.05)，其絕對(duì)差值為(4.73±4.50) mg/周，大致符合之前的文獻(xiàn)報(bào)道[10]。可能與模型納入人群的基本特征背景與本研究人群的基本特征背景存在差異有關(guān)，該研究納入的主要人群為高加索人，而本研究?jī)H檢測(cè)了患者CYP2C9和VKORC1基因型。研究表明，華法林的劑量還受CYP1A2、CYP3A4、CYP4F2、APOE、EPHX1和NQO1等基因的調(diào)控[11-12]。因此，僅憑CYP2C9和VKORC1基因型計(jì)算華法林的預(yù)測(cè)劑量可能是導(dǎo)致華法林的預(yù)測(cè)劑量明顯高于其實(shí)際維持劑量的原因之一。另外，生活方式、生理病理狀態(tài)等非遺傳因素對(duì)華法林抗凝治療亦存在顯著影響;如吸煙、飲酒、腹瀉和發(fā)熱等均可減弱華法林的抗凝作用[8]。此外，Warfarindosing模型考慮了胺碘酮、氟康唑和阿托伐他汀等通過抑制華法林體內(nèi)代謝而增強(qiáng)其抗凝作用，還有其他藥物也會(huì)影響華法林的抗凝作用，如非甾體抗炎藥如阿司匹林、塞來昔布、布洛芬等可提高華法林游離血藥濃度，增強(qiáng)抗凝作用;銀杏葉提取物、紅花和丹參等活血化瘀類中成藥可抑制血小板聚集，與華法林產(chǎn)生協(xié)同抗血栓作用[13]。由于本研究納入的樣本量較小，今后需要更大樣本量對(duì)已構(gòu)建的模型進(jìn)行驗(yàn)證或是構(gòu)建新模型，以更好地解釋華法林劑量的個(gè)體差異。

表2 華法林預(yù)測(cè)周劑量與維持周劑量的相關(guān)性

綜上所述，基于Warfarindosing網(wǎng)站預(yù)測(cè)漢族華法林用藥劑量具有一定的參考價(jià)值，可適用于漢族人群，尤其對(duì)CYP2C9*1/*1VKORC1AA型漢族患者華法林的周劑量預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性較高，具有較高的臨床參考意義;但對(duì)于漢族CYP2C9*1/*1VKORC1GA基因型患者，華法林的劑量預(yù)測(cè)亦存在局限性，有待于進(jìn)一步臨床研究。