龍 濤 郎 松

(中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院腫瘤科,重慶市 400037,電子郵箱：longtao198406@sina.com)

肺癌是全球癌癥患者死亡的主要原因[1],每年造成約130萬人死亡[2],其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占所有肺部惡性腫瘤的80%以上,并且大多數(shù)患者在發(fā)病時(shí)已處于疾病晚期[3]。盡管手術(shù)及放化療技術(shù)在不斷進(jìn)步,但NSCLC患者的5年生存率仍低于20%[4]。因此,如何對(duì)NSCLC的臨床療效及預(yù)后進(jìn)行評(píng)估,是目前亟待解決的問題。循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是一種基于血液的敏感生物標(biāo)記物,在監(jiān)測(cè)晚期癌癥中具有較高的臨床價(jià)值[5]。ctDNA水平可反映腫瘤負(fù)荷,有助于監(jiān)測(cè)腫瘤對(duì)治療的反應(yīng)；此外,ctDNA突變也可以反映腫瘤對(duì)特定化療藥物的敏感性[6]。本研究分析NSCLC患者化療后ctDNA水平與預(yù)后的相關(guān)性,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料及方法

1.1 臨床資料 納入2017年1月至2018年1月于我院進(jìn)行化療的77例NSCLC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性NSCLC患者,經(jīng)病理學(xué)診斷明確。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他部位腫瘤；(2)合并心、腦、腎等臟器嚴(yán)重病變；(3)合并各種急、慢性感染；(4)嚴(yán)重精神疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者。根據(jù)腫瘤是否進(jìn)展將患者分為進(jìn)展組29例及無進(jìn)展組48例。兩組患者的年齡、性別等一般資料比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 觀察指標(biāo) 所有患者均予NSCLC標(biāo)準(zhǔn)化療方案,如順鉑或卡鉑聯(lián)合吉西他濱等一線化療方案,于化療方案結(jié)束后1周檢測(cè)患者以下指標(biāo)。

1.2.1 癌胚抗原、糖類抗原125、神經(jīng)元特異烯醇化酶水平測(cè)定：所有患者均于清晨抽取空腹靜脈血4 mL,混勻后以3 000 r/min離心10 min,分離血清,放置于-20℃冰箱內(nèi)備用；采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)癌胚抗原、糖類抗原125、神經(jīng)元特異烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE),儀器為i2000型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國雅培公司),試劑為同廠配套產(chǎn)品(批號(hào)：S20160241),操作過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.2 ctDNA水平測(cè)定：(1)樣本收集。所有患者均于清晨抽取空腹靜脈血2 mL,于標(biāo)本采集后2 h內(nèi)進(jìn)行離心(3 000 r/min,10 min),將上清血漿部分吸至潔凈離心管,繼續(xù)離心(3 000 r/min,10 min)完全去除血細(xì)胞成分后置于干燥潔凈凍存管中,置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2)血漿ctDNA抽提及純化。嚴(yán)格按照QIAamp DNA Blood Mini Kit(德國Qiagen公司)試劑盒的操作步驟進(jìn)行血漿DNA的抽提,每2 mL血漿可獲得300 μL的DNA。(3)ctDNA定量分析。采用pH 7.0～8.5的緩沖液將熒光染料SYBR Green Ⅰ(美國Molecular Probes公司)稀釋成1 ∶3 000的濃度備用。取10 μL血漿DNA置于透明載板上,與1 ∶3 000熒光染料SYBR Green Ⅰ等比例稀釋并充分混勻后置于紫外與可見光成像分析系統(tǒng)(美國賽默飛公司)中,在激發(fā)光波長(zhǎng)為345 nm、吸收波長(zhǎng)500 nm的條件下,攝影獲取圖像,經(jīng)軟件系統(tǒng)分析讀取其發(fā)光強(qiáng)度。將不同樣本DNA的發(fā)光強(qiáng)度代入根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)含量DNA 的發(fā)光強(qiáng)度所做的回歸方程(Y=133.17+39.458X),分別計(jì)算其相應(yīng)的DNA 濃度。如果樣本發(fā)光強(qiáng)度超過標(biāo)準(zhǔn)DNA發(fā)光強(qiáng)度范圍,則將樣本稀釋后再進(jìn)行定量,直到所測(cè)值在標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍內(nèi)。每次對(duì)同一血漿樣本檢測(cè)3次,取其平均值。

1.3 隨訪 化療結(jié)束后對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪。前6個(gè)月內(nèi)每2個(gè)月進(jìn)行1次門診隨訪,之后每6個(gè)月進(jìn)行1次門診隨訪(主要復(fù)查肺CT)。隨訪截止日期為2019年1月。若患者病情出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡則記為疾病進(jìn)展；記錄患者的疾病進(jìn)展情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)；應(yīng)用Cox回歸模型分析患者疾病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；應(yīng)用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線評(píng)估不同指標(biāo)預(yù)測(cè)患者疾病進(jìn)展的效能,采用DeLong法比較曲線下面積(area under the curve,AUC)的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組化療后癌胚抗原、糖類抗原125、NSE及ctDNA水平比較 化療后,進(jìn)展組患者的癌胚抗原、糖類抗原125、NSE及ctDNA水平均高于未進(jìn)展組(均P<0.05),見表2。

表2 兩組化療后血癌胚抗原、糖類抗原125、NSE及ctDNA水平比較(x±s)

2.2 NSCLC患者化療后疾病進(jìn)展的影響因素 以癌胚抗原、糖類抗原125、NSE及ctDNA水平為自變量(均為連續(xù)變量),以疾病進(jìn)展為因變量(無進(jìn)展=0,進(jìn)展=1),進(jìn)行多因素Cox回歸。結(jié)果顯示，癌胚抗原、糖類抗原125、NSE及ctDNA水平升高均是NSCLC患者化療后疾病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均P<0.05),見表3。

表3 NSCLC患者化療后疾病進(jìn)展的影響因素分析

2.3 不同指標(biāo)預(yù)測(cè)NSCLC患者化療后疾病進(jìn)展的診斷效能 應(yīng)用ctDNA預(yù)測(cè)NSCLC患者化療后疾病進(jìn)展的AUC高于癌胚抗原、糖類抗原125、NSE(z=3.198,P=0.001;z=3.657,P<0.001;z=4.978,P<0.001)。其中,ctDNA的最佳截點(diǎn)為29.50 μg/L,此時(shí)其預(yù)測(cè)NSCLC患者化療后發(fā)生進(jìn)展的敏感性為100.00%,特異性為97.92%,均高于其余指標(biāo)。見圖1及表5。

圖1 不同指標(biāo)預(yù)測(cè)NSCLC患者化療后疾病進(jìn)展的ROC曲線

表5 不同指標(biāo)預(yù)測(cè)NSCLC患者化療后疾病進(jìn)展的效能

3 討 論

肺癌是導(dǎo)致世界上癌癥相關(guān)死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤,其中大多數(shù)肺癌為NSCLC(占85%)[7]。盡管腫瘤學(xué)科在不斷發(fā)展,手術(shù)及放化療等治療技術(shù)在不斷完善,NSCLC患者的預(yù)后仍不樂觀,NSCLC患者的總體5年生存率仍然很低,約為16%[8]。目前NSCLC的治療仍以手術(shù)、放化療治療為主,其中NSCLC術(shù)后5年生存率不足15%[9]。

目前,臨床常用癌胚抗原、糖類抗原125、NSE等血液學(xué)指標(biāo)對(duì)NSCLC患者治療的臨床療效及預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)。癌胚抗原是多種癌癥中最常用的腫瘤標(biāo)志物[10]。癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子5在各種惡性腫瘤中持續(xù)過度表達(dá),與患者的不良臨床結(jié)果和總體存活率降低相關(guān),因此其成為一種突出的臨床癌癥生物標(biāo)志物,廣泛用于早期診斷[11]。但癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子5的敏感性和特異性不高,且臨床適用性相對(duì)有限[12]。糖類抗原125是一種黏液性糖蛋白，與NSCLC疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[13]。Díez等[14]曾報(bào)告,術(shù)前血清糖類抗原125水平與可手術(shù)的NSCLC患者的TNM分期有關(guān),可提供額外的預(yù)后信息,且血清糖類抗原125水平是監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)和術(shù)后播散的指標(biāo)。NSE是一種糖分解烯醇酶,由神經(jīng)元及神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞分泌，在NSCLC中具有較好的敏感性及特異性，目前被認(rèn)為是NSCLC預(yù)后不良的標(biāo)志,部分NSCLC患者NSE水平升高,而這可能與預(yù)后不良有關(guān)[15]。然而上述指標(biāo)的診斷效能較低,故目前臨床提出通過監(jiān)測(cè)ctDNA對(duì)患者的預(yù)后進(jìn)行評(píng)估。

ctDNA是腫瘤細(xì)胞釋放到血液中的單鏈或雙鏈DNA,攜帶有原始腫瘤的突變基因。已知的ctDNA的基因組譜與相應(yīng)腫瘤的基因組譜匹配度高,并由于其檢測(cè)具有可再現(xiàn)、非侵入性和易于獲得等特征，在肺癌的管理中起著至關(guān)重要的作用[16]。近年來的研究表明,ctDNA篩查可顯著改善目前的腫瘤診斷系統(tǒng),甚至有助于腫瘤的早期診斷[17]。ctDNA水平的波動(dòng)與多種因素相關(guān),其中包括腫瘤類型、進(jìn)展、治療效果和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散[18]。近期,Chen等[19]發(fā)現(xiàn),ctDNA能夠?qū)崟r(shí)敏感地反映NSCLC患者的腫瘤基因突變信息及腫瘤負(fù)荷,可用于監(jiān)測(cè)患者術(shù)后微小病灶的殘留,并評(píng)估腫瘤復(fù)發(fā)的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果顯示,化療后進(jìn)展組患者的癌胚抗原、糖類抗原125、NSE及ctDNA水平均高于未進(jìn)展組(均P<0.05),且癌胚抗原、糖類抗原125、NSE及ctDNA水平升高均是化療后NSCLC患者疾病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均P<0.05)。這提示ctDNA與臨床常用的血液腫瘤標(biāo)志物均可用于化療后NSCLC患者的預(yù)后評(píng)估。而進(jìn)一步ROC曲線分析結(jié)果顯示,應(yīng)用ctDNA預(yù)測(cè)NSCLC患者疾病進(jìn)展的AUC達(dá)0.999,敏感性為100.00%,特異性為97.92%,均高于癌胚抗原、糖類抗原125和NSE,表明ctDNA對(duì)化療后NSCLC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)效能較高,且優(yōu)于傳統(tǒng)的血液腫瘤標(biāo)志物。

綜上所述,ctDNA在評(píng)估化療后NSCLC患者預(yù)后方面具有較高的效能,值得臨床使用。但ctDNA檢測(cè)價(jià)格相對(duì)較高,且檢驗(yàn)程序復(fù)雜,難以做到臨床推廣。此外,本研究?jī)H納入我院化療的NSCLC患者,且僅對(duì)單一指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。因此,還應(yīng)繼續(xù)行大樣本、多中心的臨床試驗(yàn),并應(yīng)進(jìn)一步比較多種指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)與ctDNA單一檢測(cè)在評(píng)估NSCLC化療患者預(yù)后方面的效能及價(jià)值。