許蕙，陳昶，王彥生

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院 手外科，遼寧 沈陽(yáng) 110024）

骨肉瘤是最常見(jiàn)的骨原發(fā)惡性腫瘤。好發(fā)部位為股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端，其次為肱骨近端[1-2]。目前隨著手術(shù)和多種藥物聯(lián)合的新輔助化療的應(yīng)用，骨肉瘤患者5 年生存率提高到了60%～75%，然而仍有30%～40%的患者發(fā)生肺轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，5 年生存率僅為20%[3-4]。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)Livin 參與細(xì)胞的多種生理學(xué)過(guò)程，通過(guò)影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期控制細(xì)胞凋亡[5-6]。Livin 與多種腫瘤發(fā)展和患者的預(yù)后關(guān)系密切，如腎上腺皮質(zhì)腫瘤、膀胱癌、結(jié)腸直腸癌等[7]。目前Livin 在其他腫瘤中的研究較多，而在骨肉瘤中的研究相對(duì)較少。Bcl-2家族是細(xì)胞生存和凋亡信號(hào)的重要整合因子，Bcl-2與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及其產(chǎn)生耐藥關(guān)系密切[8]。本次研究采用免疫組織化學(xué)法（SP 法）檢測(cè)骨肉瘤組織中Bcl-2 蛋白和Livin 蛋白的表達(dá)情況，并探究它們的表達(dá)與骨肉瘤各臨床病理參數(shù)是否有關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步探究?jī)烧叩南嚓P(guān)性，為骨肉瘤的臨床診斷和治療提供一些新的思路。

1 資料與方法

1.1 病例收集

收集沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院與遼寧省腫瘤醫(yī)院近20 年的骨肉瘤組織蠟塊45 例作為實(shí)驗(yàn)組，骨軟骨瘤45 例作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組：女11 例，男34例；年齡 14～75 歲；平均 23 歲（＜23 歲者 21 例，≥23 歲者 24 例）；病理學(xué)分型：骨母細(xì)胞型 28 例，軟骨母細(xì)胞型10 例，纖維母細(xì)胞型4 例，其他型3 例；腫瘤部位：股骨27 例，脛骨11 例，肱骨4 例，其他部位 3 例；Enneking 分期：Ⅰ+ⅡA 期 7 例，ⅡB+Ⅲ期38 例；按病理分級(jí)：高分化9 例，中低分化36 例。對(duì)照組：女 8 例，男 39 例；年齡 17～73 歲；平均 22 歲（＜23 歲 24 例，≥23 歲 21 例）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴病理活檢確診為骨肉瘤，病理及臨床資料保存完整；⑵術(shù)前未接受放化療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴術(shù)前接受過(guò)放化療；⑵病理及臨床資料不完整。

1.2 免疫組化實(shí)驗(yàn)

試劑：一抗：Livin（武漢谷歌生物科技有限公司），工作濃度為 1∶200；一抗：Bcl-2（武漢谷歌生物科技有限公司），工作濃度為1∶700。二抗：HRP標(biāo)記山羊抗兔鼠通用二抗（Servicebio），組化試劑盒：DAB 顯色劑（Servicebio）。

實(shí)驗(yàn)方法：⑴烤片：在60℃烤箱內(nèi)烤片4 h；⑵石蠟切片脫蠟至水；⑶30%H2O2稀釋為3%，室溫孵育10 min，蒸餾水沖洗3 次；⑷原修復(fù)；⑸涼水中冷卻10 min，水洗 1 次；⑹PBS 液浸泡 3 次，每次 3 min。⑺10%山羊血清（PBS 液稀釋?zhuān)┓忾]，室溫 10 min；⑻加入一抗；⑼室溫放置20 min，PBS 液沖洗3 次（每次5 min）；⑽滴加適量二抗工作液，37℃孵育30 min；⑾加顯色劑DAB 顯色（5 min）；⑿蒸餾水充分沖洗；⒀復(fù)染；⒁蒸餾水充分沖洗至無(wú)明顯紫（紅）色；⒂脫色；⒃脫水；⒄拿出晾干，中性樹(shù)脂加蓋玻片，自然晾干后鏡下觀察，圖像采集。

1.3 結(jié)果閱片判定

細(xì)胞染色標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色。切片均在400 倍鏡下選5 個(gè)視野，利用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)分析。陽(yáng)性判斷采用 Sinicroper改良法：記錄切片中陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)所占比例評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為0 分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 5%～25%為 1 分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 25%～50%為 2 分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)50%～75%為3 分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞75%為4分。染色強(qiáng)度分為4 級(jí)：不顯色為0 分；淺黃色為1分；棕黃色為2 分；深棕色為3 分。切片記分＝陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)×染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)。結(jié)果判定：切片計(jì)分小于 1 分為陰性（-），切片計(jì)分1～3 分為弱陽(yáng)性（＋），切片計(jì)分4～5 分為中度陽(yáng)性（＋＋），切片計(jì)分＞5 分為強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋）[9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

Livin 和Bcl-2 在骨肉瘤和骨軟骨瘤中的表達(dá)差異，及Livin 、Bcl-2 在骨肉瘤各臨床病理參數(shù)中的表達(dá)差異采用χ2檢驗(yàn)，Livin 和Bcl-2 之間的關(guān)系采用相關(guān)性分析。本研究所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均使用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Livin 在骨肉瘤和骨軟骨瘤中免疫組化結(jié)果

Livin 主要表達(dá)于細(xì)胞漿。陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色（圖1），陰性表達(dá)為藍(lán)色（圖2）。45 例骨肉瘤中30例表達(dá)陽(yáng)性，15 例表達(dá)陰性，陽(yáng)性表達(dá)率為66.7%（圖5）；45 例骨軟骨瘤中0 例表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率為0%。在骨肉瘤組中Livin 蛋白的陽(yáng)性率顯著高于骨軟骨瘤組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=45.00，P＜0.01）。

圖2 骨肉瘤中Livin 的陰性表達(dá)（HE×400）

圖3 骨軟骨瘤中Livin 的陰性表達(dá)（HE×200）

圖4 骨軟骨瘤中Livin 的陰性表達(dá)（HE×400）

圖5 骨肉瘤中Livin 的表達(dá)情況

2.2 Bcl-2 在骨肉瘤和骨軟骨瘤中免疫組化結(jié)果

Bcl-2 主要表達(dá)于細(xì)胞漿。陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色（圖6），陰性表達(dá)為藍(lán)色（圖7）。45 例骨肉瘤中28 例陽(yáng)性，17 例陰性，陽(yáng)性表達(dá)率為 62.2%（圖 10）；45 例骨軟骨瘤中1 例表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率為2.2%。Bcl-2 在骨肉瘤組中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于骨軟骨瘤組，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=39.2.00，P＜0.01）。

圖6 骨肉瘤中Bcl-2 的陽(yáng)性表達(dá)（HE×400）

圖7 骨肉瘤中Bcl-2 的陰性表達(dá)（HE×400）

圖8 骨軟骨瘤中Bcl-2 的陰性表達(dá)（HE×200）

圖9 骨軟骨瘤中Bcl-2 的陰性表達(dá)（HE×400）

圖10 骨肉瘤中Bcl-2 的表達(dá)情況

2.3 骨肉瘤組織中Livin 表達(dá)與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

在不同性別、年齡、腫瘤部位及病理分型的骨肉瘤切片中Livin 的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)，在不同病理分級(jí)(高分化、中低分化) 中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.656，P＜0.010），在不同Ennking 分期(Ⅰ+ⅡA，ⅡB+Ⅲ期)中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.634，P＜0.013）（表 1，圖 11）。

2.4 骨肉瘤組織中Bcl-2 的表達(dá)與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

圖11 Livin 在不同Ennking 分期、不同病理分級(jí)中的表達(dá)情況

表1 骨肉瘤組織中Livin 蛋白表達(dá)與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

不同性別、年齡、腫瘤部位及病理分型的切片中Bcl-2 的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；在不同病理分級(jí)(高分化、中低分化) 中的Bcl-2 表達(dá)差異有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義 （χ2=5.678，P=0.017）；在 不 同Ennking 分期(Ⅰ+ⅡA，ⅡB+Ⅲ期)中 Bcl-2 的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.869，P=0.015）（表 2，圖 12）。

2.5 骨肉瘤組織中LIVIN 表達(dá)與BCL-2 之間關(guān)系

根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組30 例Livin 蛋白表達(dá)陽(yáng)性的切片中24 例Bcl-2 表達(dá)陽(yáng)性，6 例Bcl-2表達(dá)陰性，15 例Livin 蛋白表達(dá)陰性的切片中4 例Bcl-2 表達(dá)陽(yáng)性，11 例 Bcl-2 表達(dá)陰性；28 例 Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性的切片中24 例Livin 蛋白表達(dá)陽(yáng)性，4 例表達(dá)陰性，17 例Bcl-2 蛋白表達(dá)陰性切片中6例 Livin 蛋白表達(dá)陽(yáng)性，11 例表達(dá)陰性。經(jīng)Spearman 等級(jí)相關(guān)分析Livin 與Bcl-2 表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.519，P＜0.01）（表 3，圖 13）。

3 討論

圖12 Bcl-2 在不同Encking 分期、不同病理分級(jí)中的表達(dá)情況

表2 骨肉瘤組織中Bcl-2 蛋白表達(dá)與各臨床病理參數(shù)之間關(guān)系

表3 骨肉瘤組織中Livin 和Bcl-2 表達(dá)的相關(guān)性分析

圖13 Livin 表達(dá)與Bcl-2 表達(dá)的關(guān)系

骨肉瘤是一種起源于成骨間葉細(xì)胞的惡性腫瘤，好發(fā)于青少年，是最常見(jiàn)的骨原發(fā)性惡性腫瘤[1]。其病程短，進(jìn)展快，易早期轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅青少年的健康。雖然隨著多藥物聯(lián)合化療的應(yīng)用，患者的生存率得到了明顯的改善，但仍有相當(dāng)一部分患者發(fā)生肺轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，預(yù)后較差[8]。而且隨著患者生存率的提高和壽命的延長(zhǎng)，化療的副作用和耐藥帶來(lái)的一系列問(wèn)題變得越來(lái)越明顯。因此醫(yī)務(wù)工作者們渴望找到一種新的副作用小、療效確切的治療方案。

骨肉瘤的具體發(fā)生機(jī)制目前尚不十分清楚。普遍認(rèn)為腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是多基因、多因素、多步驟的綜合過(guò)程。正常細(xì)胞周期的破壞、細(xì)胞凋亡受到抑制、腫瘤細(xì)胞增殖是腫瘤發(fā)展的重要因素。在這個(gè)過(guò)程中IAP 家族和Bcl-2 家族發(fā)揮著重要的作用[9]。Livin 是近年新發(fā)現(xiàn)的一種具有較強(qiáng)抗凋亡能力的凋亡抑制蛋白，屬于IAP 家族。Livin 蛋白只存在于發(fā)育過(guò)程中的組織和一些腫瘤中，而在大多數(shù)正常成人組織中不表達(dá)[10]。有研究證實(shí)Livn 蛋白能和 caspase3、caspase7、caspase9 前體相互反應(yīng)產(chǎn)生共沉淀，進(jìn)而抑制它們的活性，從而起到抑制細(xì)胞凋亡的作用[11]。有研究發(fā)現(xiàn) JNK1（Jun 氨基酸末端激酶1）、JNK2（Jun 氨基酸末端激酶2）可以被Livin蛋白選擇性的激活，進(jìn)而抑制TNF-α（腫瘤壞死因子）和ICE(白細(xì)胞介素1 轉(zhuǎn)化酶)，達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的目的。Livin 在多種腫瘤組織中高表達(dá)，而在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)[12]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)Livin 與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切。Livin 在彌漫大B 淋巴細(xì)胞瘤中，被證實(shí)與彌漫大B淋巴細(xì)胞瘤的原發(fā)部位、IPI 評(píng)分、病理類(lèi)型等有關(guān)，有望成為判斷DLBCL 預(yù)后的指標(biāo)[13]。Bcl 家族是細(xì)胞生存和凋亡信號(hào)的重要整合因子，該家族分為三大類(lèi)：抗凋亡成員：Bcl-2、Bcl-x 等，抑制細(xì)胞凋亡[14]；促凋亡成員：Bax、Bak 等；以及 BH3-only 死亡蛋白?？沟蛲龀蓡T和促凋亡成員間相互作用設(shè)定了細(xì)胞死亡的閾值[11，15]。

本次研究中Livin 和Bcl-2 在骨肉瘤組中的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于骨軟骨瘤組，說(shuō)明Livin 和Bcl-2 可能與骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系。Ennking 分期ⅡB+Ⅲ期中Livin 的陽(yáng)性率明顯高于Ⅰ+ⅡA 期，表明骨肉瘤從早期（Ⅰ+ⅡA 期）發(fā)展到中晚期（ⅡB+Ⅲ期）過(guò)程中Livin 可能扮演了重要角色，如果我們?cè)谀[瘤早期及時(shí)使用靶向治療藥物沉默Livin 基因，抑制其表達(dá)，可能延緩甚至阻止腫瘤繼續(xù)發(fā)展。病理分級(jí)中、低分化組中Livin 的陽(yáng)性率明顯高于高分化組，提示骨肉瘤組織病理分化程度越低Livin 的表達(dá)陽(yáng)性率越高，表明Livin 能提示骨肉瘤的病理分化程度。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析在骨肉瘤中Livin 的表達(dá)與Bcl-2 的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，兩者在骨肉瘤中可能有協(xié)同作用。

綜上所述，Livin 是新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白，在多種腫瘤中特異表達(dá)，參與多個(gè)抑制細(xì)胞凋亡的途徑，相對(duì)其他IAP 成員Livin 具有重要的地位。Bcl-2 在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中具有重要作用。聯(lián)合研究Livin 和Bcl-2 與骨肉瘤組織的關(guān)系，及兩者間的關(guān)系，必將為骨肉瘤的診斷、治療帶來(lái)新的思路和方法。

本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了Livin 與Bcl-2 在骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá)，與骨肉瘤的Ennking 分期及病理分級(jí)程度相關(guān)。在骨肉瘤中Livin 的表達(dá)與Bcl-2 呈正相關(guān)關(guān)系。檢測(cè)Livin 和Bcl-2 有可能對(duì)骨肉瘤的診斷和預(yù)后判斷有所幫助。Livin 極可能成為骨肉瘤基因靶向治療的新位點(diǎn)。