王華偉薛金偉*董洪亮凌麗焦建寶韓翠玉

周圍神經損傷后，在神經修復的過程中會形成神經瘢痕，而瘢痕的形成會使神經外膜與周圍組織粘連，對神經束造成物理性卡壓。長期的卡壓存在，造成神經缺血，引起髓鞘變性壞死，阻礙受損神經與遠端效應器建立有效連接[1-2]，影響神經的正常形態(tài)結構及功能恢復。因此，如果能減少瘢痕的形成，減輕對神經的物理壓迫和阻擋，便能夠在一定程度上改善神經功能恢復情況[3]。膠原蛋白的沉積是瘢痕形成的基本環(huán)節(jié)，成纖維細胞是合成膠原的主要細胞，成纖維細胞合成與分泌膠原能力的增強或成纖維細胞的大量增殖，將導致膠原沉積量增加，從而形成瘢痕[4]。近年來研究發(fā)現，細胞因子抑制劑（cytokine inhibitors）吡非尼酮（pirfenidone，PFD）能明顯抑制成纖維細胞膠原蛋白的分泌，抑制瘢痕形成[5]。PFD已經在治療其他組織瘢痕和纖維化疾病的研究中取得了豐碩的成果[6-7]，而對神經瘢痕的形成有無抑制作用目前國內外未見相關報道。研究發(fā)現，神經瘢痕同其他組織修復時的瘢痕在組織學上很相近，也是以Ⅰ型膠原蛋白為主的細胞外基質在損傷處的異常沉積為特征[8]。所以筆者推測，PFD同樣能夠抑制神經瘢痕的形成，促進功能恢復。本實驗應用這一研究模型和方法，觀察PFD對神經吻合口處瘢痕形成及神經功能恢復的影響，為治療神經損傷提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

選用健康2月齡雄性SD大鼠60只，體重（200±20）g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。主要實驗藥品和試劑：吡非尼酮膠囊（艾思瑞），由北京康蒂藥業(yè)有限公司生產；Ⅰ型膠原單克隆抗體和免疫組化SABC法試劑盒，均由武漢博士德生物制劑公司提供；VikingQuest型肌電誘發(fā)儀（Nicolet公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 模型制作與分組

SD 大鼠5%氯胺酮肌內注射麻醉，用量100 mg/kg[9]，俯臥位固定大鼠，無菌條件下暴露右側坐骨神經，于梨狀肌下緣1 cm無明顯分支處橫斷坐骨神經，隨后行神經外膜端端吻合術，以吻合口工整、神經干無扭轉、神經外膜稍外翻、神經束無膨出為吻合標準。同一組實驗人員操作。術后1 d隨機分為對照組、低劑量組和高劑量組，每組20只。

1.2.2 給藥方法

準確稱取定量PFD，溶于等量生理鹽水中，對照組、低劑量組、高劑量組分別按0mg/kg、25 mg/kg、100mg/kg劑量給予吡非尼酮混懸液灌胃[10-11]。PFD在水溶液中易析出，故均現用現配。檢驗符合方差齊性，采用Tukey法進行統計學處理。＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 坐骨神經功能指數（SFI）

術后第4周，三組之間兩兩比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；術后第 12周，低劑量組優(yōu)于對照組（P＜0.01），高劑量組優(yōu)于低劑量組（P＜0.01）。相關數據見表1。

1.3 觀察指標

1.3.1 坐骨神經功能指數

坐骨神經功能指數（sciaticnervefunctionalindex，SFI）是評價坐骨神經損傷后神經再生與功能恢復的可靠指標。采用自制長60 cm、寬20 cm、高10 cm 的大鼠足印行走箱，盒底鋪等長等寬的白紙。大鼠雙后肢用墨汁染色，范圍雙踝關節(jié)至雙足。使大鼠自行在行走箱兩端行走，清晰記錄雙后肢留下的足印（4～5個即可）。對于每只大鼠的正常足足?。╖）和損傷足足?。⊿），選擇清晰的印跡測量3個指標：A（足印長度）；B（足印寬度）；C（中間三趾寬度）。通過Bain 公 式：SFI=109.5（SB ZB）/ZB 38.3（SA ZA）/ZA+13.3（SC ZC）/ZC 8.8。計算得出實驗數據，SFI=0代表功能正常，SFI= 100代表功能完全喪失[12]。

1.3.2 神經電生理檢測動作電位

測定 SFI后，分別于術后第4、12周通過肌電圖記錄儀記錄大鼠坐骨神經動作電位波幅、傳導速度、潛伏期。于肌腹中插入記錄電極，在損傷神經段的近端及遠端分別放置電極，且遠、近端放置電極的距離大于5 mm，參考電極距記錄電極5 mm，用Viking Quest型肌電誘發(fā)儀進行復合肌肉動作電位檢測，刺激量為5 mA，刺激時間0.2 ms，刺激頻率為1 Hz，連接計算機記錄動作電位波幅、傳導速度、潛伏期。

1.3.3 Ⅰ型膠原蛋白免疫組織化學染色

術后第4、12周，過量麻醉處死大鼠并暴露右側坐骨神經。以吻合口為中心切取坐骨神經1.5cm，經標本固定—乙醇梯度脫水—二甲苯透明—石蠟包埋，切片厚4m，采用SABC法，染色方法按照試劑說明書步驟進行，DAB顯色，脫水封片，光學顯微鏡下觀察。

采用美國 Image-pro plus 6.0軟件對Ⅰ型膠原蛋白免疫組化切片進行圖像分析。

1.4 統計學分析

采用 SPSS 25.0軟件進行統計學分析，數據以均數±標準差表示。各組實驗數據經K-S檢驗符合正態(tài)分布，Levene

表1 術后第4、12周各組SFI（）

表1 術后第4、12周各組SFI（）

注：術后第4周，三組之間兩兩比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；術后第12周，三組之間兩兩比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。

組別 n 第4周 第12周對照組 10 74.14±3.11 77.87±2.21低劑量組 10 73.67±2.25 68.92±2.25高劑量組 10 72.67±2.32 56.05±3.37 F值 - 0.836 169.652 P值 - 0.444 ＜0.01

2.2 神經電生理檢測

術后第4周，三組之間神經傳導速度、波幅、潛伏期兩兩比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表2；術后第12周，與對照組相比，低劑量組和高劑量組神經傳導速度顯著增快（P＜0.05），潛伏期縮短（P＜0.05），波幅升高（P＜0.05），且高劑量組優(yōu)于低劑量組（P=0.016），見表3。

表2 術后4周各組大鼠坐骨神經電生理分析結果（）

表2 術后4周各組大鼠坐骨神經電生理分析結果（）

注：術后4周，三組之間神經傳導速度、潛伏期、波幅兩兩比較，差異均無統計學意義（＞0.05）。

組別 n 神經傳導速度（m/s） 潛伏期（ms）對照組 10 14.7±2.3 1.78±0.10低劑量組 10 15.6±2.1 1.79±0.09高劑量組 10 16.1±3.1 1.76±0.11 F值 - 0.750 0.242 P值 - 0.482 0.787波幅（mV）9.0±1.7 9.7±1.9 9.9±2.4 0.482 0.623

表3 術后12周各組大鼠坐骨神經電生理分析結果（）

表3 術后12周各組大鼠坐骨神經電生理分析結果（）

注：術后12周，三組之間神經傳導速度、潛伏期、波幅兩兩比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

組別 n 神經傳導速度（m/s） 潛伏期（ms）對照組 10 16.6±1.1 1.73±0.94低劑量組 10 18.2±1.6 1.56±0.81高劑量組 10 19.9±1.1 1.41±0.59 F值 - 16.957 40.821 P值 - ＜0.01 ＜0.01波幅（mV）10.1±1.1 14.1±1.2 16.4±1.0 84.197＜0.01

2.3 Ⅰ型膠原蛋白免疫組織化學染色及圖像分析

鏡下可見膠原纖維被染成棕黃色，低劑量組（見圖1）和高劑量組（見圖2）吻合口處Ⅰ型膠原蛋白增生少，神經纖維排列整齊，空泡變性少見，且高劑量組更顯著；對照組Ⅰ型膠原蛋白在吻合口處有明顯增生，有的甚至形成膠原團塊，神經纖維稀疏，組織間存在廣泛空泡變性（見圖3）；圖像分析表明，術后第4周，與對照組相比，低劑量組和高劑量組神經吻合口處Ⅰ型膠原蛋白沉積量明顯減少（P＜0.01），低劑量組與高劑量組相比，差異無統計學意義（P=0.893）；術后第12周，與對照組相比，低劑量組和高劑量組神經吻合口處Ⅰ型膠原蛋白沉積量明顯減少（P＜0.01），且高劑量組比低劑量組減少更明顯（P=0.011）（見表4）。

圖1 Ⅰ型膠原纖維免疫組化染色：低劑量組（×100，縱切）

圖2 Ⅰ型膠原纖維免疫組化染色：高劑量組（×100，縱切）

圖3 Ⅰ型膠原纖維免疫組化染色：對照組（×100，縱切）

表4 術后第4、12周各組Ⅰ型膠原蛋白在損傷處面積百分比（，%）

表4 術后第4、12周各組Ⅰ型膠原蛋白在損傷處面積百分比（，%）

注：術后第4周，低劑量組和高劑量組與對照組比較＜0.01；高劑量組與低劑量組比較=0.893；術后第12周，三組之間兩兩比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

組別 n 第4周 第12周對照組 10 58.03±1.84 63.23±2.74低劑量組 10 39.12±3.12 43.11±3.37高劑量組 10 38.62±2.26 39.14±2.28 F值 - 201.719 207.758 P值 - ＜0.01 ＜0.01

3 討論

各種原因引起的周圍神經損傷，在神經修復的過程中神經吻合口處不可避免會形成瘢痕。局部微環(huán)境中存在的細胞因子（growthfactor，GF）等生物活性物質在瘢痕的形成中扮演著重要角色，該過程中有多種生長因子的參與，其中轉化生長因子 1（transforming growth factor1，TGF 1）是最強有力的促纖維化細胞因子之一[13-14]，與瘢痕形成過程關系最密切，它通過促進成纖維細胞活化增殖，影響以Ⅰ型膠原蛋白為主的瘢痕組織的形成[15-16]。研究發(fā)現，TGF 1在瘢痕疙瘩組織中呈高表達[17]，TGF 1抗體能降低 TGF 1水平，減少I型膠原蛋白沉積，從而抑制瘢痕形成[18]。本實驗結果表明，低劑量組和高劑量組Ⅰ型膠原蛋白沉積量與對照組相比明顯減少（P＜0.01），且隨著用藥時間的延長，術后12周，高劑量組Ⅰ型膠原蛋白沉積量少于低劑量組（P=0.011）。筆者通過對大鼠的神經電生理和足跡分析發(fā)現，低劑量組和高劑量組大鼠神經功能恢復情況明顯優(yōu)于對照組（P＜0.01）。這與前人通過利用抗TGF 1抗體抑制TGF 1減少神經瘢痕中膠原蛋白沉積的結果相符合[4]。藍蔚等[5]也證實，PFD對人增生性瘢痕成纖維細胞膠原蛋白的分泌有明顯的抑制作用。周乾坤利用地塞米松、曹鵬利用羊膜等通過減少瘢痕形成從而促進神經功能恢復也取得了滿意效果[19-20]。

PFD作為一種有效的細胞因子抑制劑[21-22]，通過抑制TGF 1使成纖維細胞增殖受抑制，減少I型膠原的合成[23-24]，最終促進神經功能的恢復。需要注意的是，瘢痕形成是創(chuàng)傷修復過程中重要的一環(huán)，適量的 TGF 1有利于損傷修復和傷口愈合，過多的 TGF 1則會影響瘢痕增生和纖維化，在周圍神經損傷后不利于神經的再生[4]，影響功能恢復。本實驗僅是證明了PFD能夠通過抑制TGF 1減少成纖維細胞增值，最終減少瘢痕形成，關于PFD如何能在即不影響傷口的愈合，又能促進神經功能恢復的最適濃度，我們還需要在未來的研究中進一步探討。

臨床工作中，常遇到神經卡壓綜合征的患者，如腕管、肘管綜合征，術中發(fā)現神經周圍瘢痕形成越嚴重的患者，臨床癥狀越嚴重，術后恢復越緩慢。有些尺神經前置術后半年小魚際萎縮返院手術的患者，術中發(fā)現尺神經前置后，神經周圍瘢痕增生嚴重，嚴重卡壓尺神經，導致神經水腫。一些外傷病人，即使做了神經吻合術后，由于瘢痕的大量增生卡壓神經，神經功能的恢復也不甚理想，嚴重影響患者生活質量。如何減少瘢痕形成是困擾醫(yī)學界的難題，目前主要的治療方式有中藥制劑、放射療法、手術治療、激素療法、物理壓迫等，但效果欠佳。PFD抗纖維化療效肯定，本實驗為利用細胞因子抑制劑PFD抑制神經瘢痕形成，促進神經功能恢復提供了動物實驗依據，為藥物治療周圍神經損傷提供了更多思路。下一步筆者將深入分析其信號傳導通路，建立更多動物模型與現有治療方法優(yōu)劣進一步比較，為PFD臨床治療周圍神經損傷提供更充實的依據，為因神經瘢痕增生而影響功能恢復的患者提供更多有效治療方法。