束 慶，曹 智，，王丹丹，朱懷軍，葛泳含，劉蘊(yùn)星，姚 瑤，孫 雷，葛衛(wèi)紅**

1 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 藥學(xué)部，南京 210008；2 徐州醫(yī)科大學(xué)附屬邳州醫(yī)院 藥學(xué)部，徐州 221300；3 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，南京 210008

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一類以關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫病，全世界發(fā)病率約為0.24%[1]，我國(guó)大陸地區(qū)患病率為0.2%～0.4%[2]。甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）是歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）及美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）推薦治療RA 的一線藥物。關(guān)節(jié)損傷發(fā)生在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病程的早期[3，4]，治療RA 首要目標(biāo)是對(duì)疾病的早期控制，防止疾病進(jìn)展對(duì)關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞和功能的影響。但是，服用MTX 需6 個(gè)月才達(dá)到血藥濃度穩(wěn)態(tài)[5]，方可判定療效。此外，研究顯示，約30%的患者對(duì)MTX 的治療無(wú)效[6-8]。因此，MTX 在臨床用藥的困難是：能否預(yù)知MTX 對(duì)患者的療效，從而能夠早期有效控制疾病的活動(dòng)。

關(guān)于MTX 在體內(nèi)的代謝及藥理機(jī)制的發(fā)揮過(guò)程如圖1 所示：MTX 通過(guò)還原型葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體-1（reduced folate carrier 1，RFC-1）運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而谷氨酸基團(tuán)通過(guò)多聚谷氨酰胺合成酶（folylpolyglutamate synthetase，F(xiàn)PGS） 添加到MTX上，轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗑酃劝彼峄装钡剩∕TXPGn）[9]；而γ-谷氨酰水解酶（γ-glutamyl hydrolase，GGH）則可移除MTXPGn 末端的多聚谷氨酸，使之恢復(fù)成單聚谷氨酸的形式，然后很快地被三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體（ATP－binding cassette ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體）的膜蛋白家族轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞。胞內(nèi)的MTXPGn 可通過(guò)抑制：①胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TYMS）干擾蛋白質(zhì)的合成。②抑制二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）使四氫葉酸無(wú)法轉(zhuǎn)化為二氫葉酸，進(jìn)一步導(dǎo)致5，10-亞甲基四氫葉酸無(wú)法在亞甲基四氫葉酸還原酶 （5，10 -methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）的催化作用下、形成5-甲基四氫葉酸鹽，最終引起DNA 甲基化的減少。③抑制5-氨基咪唑-4 -氨甲酰核苷酸轉(zhuǎn)甲酰酶 （5 -aminoimidazole -4 -carboxamide ribonucleotide transformylase，ATIC），影響嘌呤的合成。

在甲氨蝶呤通路中，各種代謝酶的基因多態(tài)性可能影響細(xì)胞內(nèi)MTXPGn 對(duì)葉酸抑制作用的發(fā)揮效果[10]。但是，目前關(guān)于中國(guó)人群相關(guān)基因的多態(tài)性的研究較少，因此，本研究通過(guò)檢測(cè)MTX 代謝酶基因多態(tài)性在中國(guó)RA 患者中的分布情況，探討基因多態(tài)性與MTX 療效的相關(guān)性，為臨床對(duì)RA 患者的個(gè)體化用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 儀器與設(shè)備

Verity 96well PCR 儀；Gene Genius 凝膠成像儀（Syngene 公司）；3730XL 測(cè)序儀 （ABI 公司）；H6-1 電泳槽 （上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠）；DYY-8C 電泳儀（北京六一儀器廠）；HC-2518R 冷凍離心機(jī) （BBI 公司）；TGL-14G 臺(tái)式高速離心機(jī)（上海醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 藥品與試劑

甲氨蝶呤每片2.5 mg，上海上藥信誼藥廠有限公司。Pfu DNA 聚合酶、DNA 提取試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化回收試劑盒、PCR 擴(kuò)增試劑、無(wú)乙水醇、異丙醇、丙三醇等均購(gòu)自生工生物工程（上海）公司。

1.3 研究對(duì)象

選取2017 年3～11 月在醫(yī)院門診信息系統(tǒng)記錄且診斷為RA 的患者，共納入109 例。本實(shí)驗(yàn)符合人體試驗(yàn)委員會(huì)制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并按照鼓樓醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.3.1 入組標(biāo)準(zhǔn)、排除標(biāo)準(zhǔn) 入組標(biāo)準(zhǔn)：符合ACR2010年RA 診斷標(biāo)準(zhǔn)；能規(guī)律服用MTX（10 mg/周）至少3 個(gè)月，且合并用藥為不影響MTX 代謝的免疫抑制劑。排除標(biāo)準(zhǔn)：聯(lián)合其他抗風(fēng)濕藥物治療者；有嚴(yán)重心、腎等重要臟器損傷和血液系統(tǒng)疾病者（WBC<4.0×109/L，Hb<80 g·L-1，PLT<70×109/L）；肝功能ALT、AST 超過(guò)正常上限1.5 倍者；血肌酐超過(guò)正常上限者。

排除3 個(gè)月初判時(shí)ESR<20 mm·h-1、但是6 個(gè)月未達(dá)到有效標(biāo)準(zhǔn)的患者。

1.3.2 療效評(píng)價(jià) 療效判定標(biāo)準(zhǔn)為以下二種預(yù)定結(jié)果之一：（1）有效患者（穩(wěn)定劑量的MTX 治療至少6 個(gè)月，治療6 個(gè)月后的血沉（ESR）<20 mm·h-1）；（2）無(wú)效患者（穩(wěn)定劑量的MTX 治療至少3 個(gè)月，ESR 較用藥前改善率低于20%）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 患者血液采集 入組患者來(lái)院檢查時(shí)，從檢驗(yàn)科回收患者行血常規(guī)檢查后剩余的血液樣本，保存于-80 ℃冰箱中。

1.4.2 外周血DNA 的提取 應(yīng)用Wizard?Genomic DNA 提取試劑盒進(jìn)行提取。冷凍血充分解凍后混勻，取300 μL 加入到900 mL 細(xì)胞裂解液內(nèi)，顛倒5～6 次混勻，室溫靜置10 min，顛倒2～3 次，14000×g 室溫離心30s，棄去上清液，保留10～20μL，渦旋振蕩器上充分振蕩15～20 s；加入300 μL 核酸裂解液，反復(fù)吹打5～6 次，液體變粘稠；加入100 μL蛋白沉淀液，14000×g 室溫離心3 min；在另一1.5 mL EP 管中加入異丙醇300 μL，將前一步驟中的上清液全部加入其中，輕柔反復(fù)顛倒至白色絮狀沉淀出現(xiàn)；14000×g 室溫離心1 min，棄去上清液，加入室溫70%乙醇300 μL，輕柔顛倒EP 管；再于14000×g 室溫離心1 min，棄去上清液，室溫靜置15 min；加入100 μL DNA 再水化液溶解DNA，標(biāo)記后于-80 ℃冰箱保存。

1.4.3 PCR 實(shí)驗(yàn)方法

（1）引物的設(shè)計(jì)：見(jiàn)表1。

（2）PCR 反應(yīng)體系：25 μL 體系的配制為1 μL 模板、0.5μL 正向引物、0.5μL 反向引物、0.5μL 的10mM dNTP、2.5 μL Taq 緩沖液、0.2 μL 的5 U·μL-1Taq酶、20 μL 的水。

表1 引物的設(shè)計(jì)

（3）PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸30～60 s；進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸10 min。

1.4.4 基因型測(cè)序 用PCR 產(chǎn)物純化回收試劑盒對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行回收，并用測(cè)序儀對(duì)其序列進(jìn)行測(cè)定（3730XL 美國(guó)ABI），得到序列峰圖進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

資料收集后經(jīng)STATA14 進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)算各組基因型頻率及等位基因頻率，擬合優(yōu)度卡方檢驗(yàn)、確認(rèn)各組基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡。各組間基因型及等位基因頻率比較采用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 研究患者的基本特征

入組的患者共109 人，分析中包含的受試者的臨床和人口學(xué)特征，見(jiàn)表2。

表2 納入研究患者的基本特征

2.2 等位基因頻率分析

探討了6 個(gè)基因共15 個(gè)SNP 位點(diǎn)，其中ATIC（rs2372536）中共有7 位患者未檢測(cè)出基因型；ATIC（rs7563206）中共有9 位患者未檢測(cè)出基因型。等位基因頻率見(jiàn)表3。

各等位基因頻率與中國(guó)漢族人群的等位基因頻率基本相同，無(wú)明顯差異。各基因型頻率分布均作Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，除RFC-1（rs1051266）、ABCB1 （rs1045642）、TYMS （rs2853542）、TYMS（rs34743033）、ATIC（rs7563206）這幾個(gè)基因型外，其他基因頻率分布P<0.05，表明樣本來(lái)自一個(gè)較大的群體，具有群體代表性。

2.3 等位基因與療效的相關(guān)性分析

探討了6 個(gè)基因共15 個(gè)SNP 位點(diǎn)，各基因型與療效的相關(guān)性檢驗(yàn)見(jiàn)表4。

其中在ATIC（rs2372536）中共有7 位患者未檢測(cè)出基因型，即有效患者中5 位、無(wú)效患者中2 位；在ATIC（rs7563206）中共有9 位患者未檢測(cè)出基因型，即有效患者中8 位、無(wú)效患者中1 位。

2.3.1 RFC-1 基因多態(tài)性與療效的關(guān)系 RFC-1（rs1051266）的基因型分布（AA/AG/GG）在有效組和無(wú)效組的比較中未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （χ12=2.44，P1=0.12，χ22=1.16，P2=0.28，χ32=2.89，P3=0.09）。

2.3.2 ABCB1 基因多態(tài)性與療效的關(guān)系 ABCB1（rs1045642）的基因型分布（CC/CT/TT）在有效組和無(wú)效組的比較中未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （χ12=0.23，P1=0.63，χ22=0.01，P2=0.93，χ32=0.01，P3=0.93）。

2.3.3 MTHFR 基因多態(tài)性與療效的關(guān)系MTHFR（rs1801131）的基因型分布（AA/AC/CC）在有效組和無(wú)效組的比較中未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （χ12=0.001，P1=0.97，χ22=0.27，P2=0.60，χ32=0.27，P3=0.61）。MTHFR（rs1801133）的基因型分布（CC/CT/TT）在有效組和無(wú)效組的比較中未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （χ12=0.004，P1=0.95，χ22=0.07，P2=0.80，χ32=0.02，P3=0.89）。

2.3.4 TYMS 基因多態(tài)性與療效的關(guān)系 TYMS（rs2853542）的基因型分布（CC/CG/GG）在有效組和無(wú)效組比較中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ12=0.07，P1=0.79，χ22=1.56，P2=0.21，χ32=1.03，P3=0.31）。TYMS（rs34743033）的基因型分布（2R2R/2R3R/3R3R）在有效組和無(wú)效組比較中僅P1有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ12=5.69，P1=0.02），即含有三個(gè)重復(fù)序列的患者療效更好。

表3 患者M(jìn)TX 代謝酶等位基因頻率

表4 MTX 代謝酶基因多態(tài)性與療效的相關(guān)性檢驗(yàn)

2.3.5 ATIC 基因多態(tài)性與療效的關(guān)系 ATIC（rs2372536）的基因型分布（CC/CG/GG）在有效組和無(wú)效組的比較中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ12=0.57，P1=0.45，χ22=2.56，P2=0.11，χ32=2.69，P3=0.10）。ATIC（rs7563206）的基因型分布（CC/CT/TT）在有效組和無(wú)效組的比較中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （χ12=0.32，P1=0.57）。ATIC（rs12995526）的基因型分布（CC/CT/TT）在有效組和無(wú)效組的比較中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ12=1.41，P1=0.24，χ22=0.28，P2=0.60，χ32=0.33，P3=0.57）。ATIC（rs3821353）的基因型分布（GG/GT/TT）在有效組和無(wú)效組中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ12=0.85，P1=0.36，χ22=1.00，P2=0.32，χ32=1.35，P3=0.24）。ATIC （rs16853834） 的基因型分布（CC/CT/TT） 在有效組和無(wú)效組的比較中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ12=1.19，P1=0.28，χ22=0.27，P2=0.60，χ32=0.32，P3=0.57）。

2.3.6 DHFR 基因多態(tài)性與療效的關(guān)系 DHFR（rs408626）的基因型分布（AA/AG/GG）在有效組和無(wú)效組的比較中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ12=2.69，P1=0.10，χ22=1.84，P2=0.18，χ32=3.32，P3=0.07）。DHFR（rs12517451）的基因型分布（CC/CT/TT）在有效組和無(wú)效組的比較中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （χ12=0.26，P1=0.61，χ22=1.29，P2=0.26，χ32=1.23，P3=0.27）。DHFR（rs10072026）的基因型分布（TT/TC/C）在有效組和無(wú)效組的比較中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ12=3.85，P1=0.05）。DHFR（rs1643657）的基因型分布（AA/AG/GG）在有效組和無(wú)效組的比較中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ12=2.00，P1=0.16）。

3 討論

早期預(yù)測(cè)RA 患者使用MTX 后的療效反應(yīng)，以及制定MTX 個(gè)體化治療方案，以滿足RA 患者需求，這是目前臨床治療上亟須解決的問(wèn)題。因此，本研究通過(guò)入組在本院診治并服用MTX 的109 名RA患者，考察了6 個(gè)MTX 代謝途徑的關(guān)鍵酶的15 個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)TYMS（rs34743033）含有3R重復(fù)序列的患者對(duì)治療反應(yīng)效果好，即穩(wěn)定劑量的MTX 治療至少6 個(gè)月后ESR<20。

在本研究中發(fā)現(xiàn)TYMS （rs34743033） 與MTX療效的相關(guān)性，既往關(guān)于葡萄牙和塞爾維亞RA 患者的研究顯示，3R3R 基因型與MTX 治療的無(wú)反應(yīng)相關(guān)[11，12]。而Stamp LK等[13]在對(duì)108 名美國(guó)RA 患者與MTX 療效之間的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)，2R2R 基因型患者療效較好。種族人群的基因差異導(dǎo)致的療效差異可能是導(dǎo)致研究結(jié)論不同的原因。

本研究中還涉及了RFC-1（rs1051266）、TYMS（rs34743033）、DHFR（rs408626，rs10072026）等位點(diǎn)基因多態(tài)性與MTX 療效的相關(guān)性；但是都未有顯著意義，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來(lái)尋找療效差異的基因位點(diǎn)。

在國(guó)外研究方面，在對(duì)于RFC-1 的研究中，Drozdzik M 等[14]研究分析了174 名波蘭RA 患者與MTX（5～15 mg/周）療效之間的關(guān)系，提示AA 基因型患者臨床療效較好。Ghodke-puranik Y 等[9]研究分析了217 名印度RA 患者與MTX（20 mg/周）療效之間的關(guān)系，顯示含有A 等位基因的RA 患者療效更好。Hayashi H 等[15]研究分析了89 名日本RA 患者與MTX（8～12 mg/周）療效之間的關(guān)系，顯示具有G 等位基因的患者療效更差；Hashiguchi M 等[16]研究分析了99 名日本RA 患者與MTX 療效之間的關(guān)系，顯示含有AA 基因型患者療效更好。在服用MTX（4～10 mg/周）55 名日本RA 患者[17]與服用MTX（10～25 mg/周）327 名印度RA 患者[18]的研究提示，RFC-1 基因與療效無(wú)關(guān)。

ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要參與MTX 的外排，廣泛表達(dá)于腸道細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞，排泌功能影響胞內(nèi)MTX 水平。ABC 亞型ABCB1 的C3435T（rs1045642）多態(tài)性的研究，有的結(jié)果提示，與MTX 治療RA 的療效無(wú)關(guān)[19]，有的研究認(rèn)為，TT基因型的患者病情緩解率較高[20]。

MTHFR 兩個(gè)突變位點(diǎn)C677T （rs1801133）和A1298C（rs1801131）是影響酶活性重要因素。既往，較多研究關(guān)注這兩個(gè)基因多態(tài)性與MTX 的療效的相關(guān)性，但是研究結(jié)果仍不一致。其中，關(guān)于C677T（rs1801133），分析了233 名服用MTX（2.5～25mg/周）的葡萄牙RA 患者[11]，200 名服用MTX（約15 mg/周）新西蘭RA 患者[13]，67 名巴基斯坦RA 患者[19]及309名英國(guó)RA 患者[21]，結(jié)果研究均表明，該位點(diǎn)與療效無(wú)關(guān)。而研究表明，120 名服用MTX （11.7±2.9 mg/周）的捷克RA 患者與MTX 療效之間的關(guān)系，CC 型和TT 型等位基因療效更好[22]。Dervieux T 等[23]研究分析了48 名美國(guó)RA 患者與MTX 療效之間的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)，TT 基因型患者療效較差。關(guān)于A1298C （rs1801131），217 名服用MTX 20 mg/周的印度RA 患者的研究顯示，含有A 等位基因的RA患者療效更好[9]。Kato T 等[17]分析了55 名日本服用MTX 4～10 mg/周的RA 患者與MTX 療效之間的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)，AA 基因更容易使疾病緩解。但是關(guān)于120 名服用MTX（11.7±2.9 mg/周）的捷克RA 患者的結(jié)果表明，CC 型等位基因療效更好[22]。

ATIC 是腺苷途徑的重要代謝酶，該基因突變會(huì)影響細(xì)胞外腺苷的釋放。309 名服用MTX（≥15 mg/周） 的英國(guó)患者的研究提示，ATIC 的三個(gè)單核苷酸（rs3821353，rs7563206 和rs16853834）與MTX 的療效相關(guān)[24]。關(guān)于ATIC（rs2372536）這個(gè)位點(diǎn)：108 名美國(guó)RA 患者與MTX 療效之間的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)，GG 基因型與患者的療效相關(guān)[13]。

關(guān)于DHFR 的研究，服用MTX （10.2±2.8 mg/周） 的125 名西班牙RA 患者的用藥顯示，AA 型患者療效較差[25]。

需要特別指出的是，目前有關(guān)代謝酶基因多態(tài)性與療效的研究結(jié)論并不一致，分析導(dǎo)致的原因可能主要為以下幾點(diǎn)：①目前相關(guān)的研究基本屬于回顧性或橫斷面研究。因此結(jié)果的分析僅為治療期間的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，并不能全面反映患者在整個(gè)治療期的情況，從而不能全面有效地反映出基因多態(tài)性這類潛在的遺傳標(biāo)記物對(duì)MTX 療效的影響[26]。②MTX的療程、劑量和給藥途徑在各個(gè)研究之間有差異，也是造成各項(xiàng)研究結(jié)論差異的影響因素。一般亞洲人群的劑量為10 mg/周，而歐美人群高達(dá)15～20 mg/周。③各研究對(duì)疾病活動(dòng)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)有很大差異。不同研究對(duì)于入組患者疾病程度的標(biāo)準(zhǔn)和臨床觀察終點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)并不完全一致。④不同種族人群存在基因背景的差異，也可能影響研究結(jié)果的判定。

基于以上影響因素以及本研究是單中心小樣本的研究，因此，后期一方面需要擴(kuò)大樣本量和聯(lián)合多中心研究來(lái)探討中國(guó)人群基因多態(tài)性對(duì)MTX療效的影響；另一方面結(jié)合多位點(diǎn)的單倍型分析和MTX 活性產(chǎn)物的血藥濃度測(cè)定來(lái)更好地評(píng)價(jià)藥效，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)RA 患者的個(gè)體化精準(zhǔn)用藥，為患者合理、安全、經(jīng)濟(jì)用藥提供保障。