賴(lài) 恒 王國(guó)兵 溫鵬強(qiáng) 梅潔花 俞靈盈 徐明國(guó) 劉 琮 李成榮

川崎病(KD)是嬰幼兒期多發(fā)的全身性血管炎綜合征，可能與感染誘發(fā)的免疫異常有關(guān)[1-3]，但導(dǎo)致免疫反應(yīng)異常的病因及調(diào)控機(jī)制仍未完全闡明。除炎癥反應(yīng)外，臨床觀察及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明KD存在漿細(xì)胞浸潤(rùn)冠狀動(dòng)脈瘤、B細(xì)胞數(shù)量及功能異常、自身抗體反應(yīng)等，提示KD免疫發(fā)病機(jī)制可能與B細(xì)胞及其介導(dǎo)的體液免疫有關(guān)[4]。Ⅱ型輔助性T細(xì)胞(Th2)通過(guò)促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生及B細(xì)胞成熟等多種機(jī)制參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)，與多種自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[5-7]。IL-4在Th2細(xì)胞分化及導(dǎo)免疫功能介導(dǎo)中具有極為重要的作用，是后者的標(biāo)志性分子[5, 6]。但調(diào)節(jié)KD患兒IL-4基因表達(dá)及Th2細(xì)胞分化的機(jī)制尚不完全清楚。組蛋白甲基化是一種常見(jiàn)的表觀遺傳學(xué)修飾，通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)的空間構(gòu)象而促進(jìn)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄活性[8]。本文通過(guò)分析KD患兒IL-4基因組蛋白甲基化水平及其調(diào)節(jié)信號(hào)相關(guān)分子表達(dá)變化，旨在探討表觀遺傳學(xué)修飾對(duì)KD患兒IL-4表達(dá)及Th2細(xì)胞異常的影響，為KD及血管損傷的臨床診療提供參考依據(jù)。

1 方法

1.1 醫(yī)學(xué)倫理及知情同意 本研究方案經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)深圳兒童醫(yī)院(我院)倫理委員審核并獲得批準(zhǔn)(201401053)。受試者及其監(jiān)護(hù)人對(duì)研究方案及內(nèi)容均已知情，且自愿參與本研究。

1.2 KD及其急性KD診斷標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)日本川崎病研究會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)[9]：①持續(xù)發(fā)熱(39～40℃) ≥5 d；②手指或足指趾端硬性腫脹，第2～4周手腳掌、指趾尖或肛周可出現(xiàn)膜狀脫屑；③全身多形性充血皮疹，無(wú)水泡及結(jié)痂；④雙側(cè)眼結(jié)膜彌漫性充血，一般無(wú)分泌物；⑤口唇或口腔黏膜變化，如草莓舌、口咽黏膜充血，嘴唇紅腫、皸裂或流血；⑥頸部淋巴結(jié)非化膿性腫大，單側(cè)或雙側(cè)，直徑≥1.5 cm。①+②～⑥ 項(xiàng)中符合≥4項(xiàng)，且排除引起各項(xiàng)臨床表現(xiàn)的其他疾病。急性期KD：符合KD診斷，病程≤10 d且未接受IVIG治療。

1.3 KD冠狀動(dòng)脈損傷診斷標(biāo)準(zhǔn) (1)冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張：冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑<3歲>2.5 mm、～5歲>3.0 mm、≥5歲>4.0 mm；(2)冠狀動(dòng)脈瘤：①冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑4.0～8.0 mm；>5歲冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張的內(nèi)徑為正常 的1.5～4倍；②巨大冠狀動(dòng)脈瘤：冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑>8.0 mm；>5歲冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張的內(nèi)徑>正常4倍。

1.4 KD組納入標(biāo)準(zhǔn) 2016年8月至2018年12月來(lái)我院就診并診斷為KD急性期、且自愿參與本研究的KD患兒。

依據(jù)IVIG治療前和后，分為KD-IVIG治療前組和KD-IVIG治療后組；IVIG治療前后均行心臟彩色多普勒檢查，根據(jù)冠狀動(dòng)脈損傷分為冠狀動(dòng)脈損傷亞組(CAL亞組)和無(wú)冠狀動(dòng)脈損傷亞組(NCAL亞組)?；贑AL亞組患兒年齡、性別在NCAL亞組進(jìn)行匹配。

1.5 對(duì)照組納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 與KD同期來(lái)我院體檢、且年齡、性別盡可能與KD組匹配的健康兒童，排除先天性心臟病及其他免疫性疾病等。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.6.1 IL-4、IL-5、IL-13、IL-4Rα、IL-2Rγ和SOCS5 mRNA水平檢測(cè) 采用相對(duì)熒光定量PCR法：①無(wú)菌環(huán)境下采取靜脈血3 mL，乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA·Na2)抗凝，采用免疫磁珠(美國(guó)ThermoFisher公司, 11331D)分離CD4陽(yáng)性細(xì)胞，并抽提、純化總RNA；②根據(jù)試劑盒(美國(guó)ThermoFisher公司，K1632)步驟， 以總RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。③根據(jù)IL-4、IL-5、IL-13、IL-4Rα、IL-2Rγ、SOCS5及β-actin mRNA序列，采用Primer Premier 5設(shè)計(jì)、合成引物(表1)，進(jìn)行35～50循環(huán)的PCR擴(kuò)增，移取8 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠孔中，90 V恒壓，電泳30 min，回收、純化后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目的擴(kuò)增片斷的序列相一致。④參照試劑盒(大連Takara，RR402)步驟進(jìn)行相對(duì)定量分析，檢測(cè)結(jié)果以待測(cè)基因與β-actin的比值表示。

1.6.2IL-4基因組蛋白甲基化H3K4me3修飾及轉(zhuǎn)錄因子GATA3、甲基化酶MLL1結(jié)合水平檢測(cè) 采用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)：①取部分CD4+T細(xì)胞重懸于含1% 甲醛的PBS溶液， 37℃恒溫下交聯(lián)15 min后，離心去上清；②經(jīng)預(yù)冷且含1 μg·mL-1pepstatin A, 1 μg·mL-1aprotinin和1 mM PMSF的PBS溶液洗2次后，加入200 μL SDS裂解液重懸，0℃孵育15 min; ③采用超聲波將基因組DNA剪切為400～600 bp后，分別加入抗GATA3、MLL1和組蛋白H3K4me3單克隆抗體，分離、純化抗體結(jié)合DNA和input DNA；④根據(jù)IL-4基因組蛋白H3K4me3修飾位點(diǎn)序列，采用Primer Primier 5設(shè)計(jì)引物，參照試劑盒(大連Takara，RR402)步驟進(jìn)行相對(duì)定量分析，檢測(cè)結(jié)果以抗體結(jié)合DNA與input DNA比值表示。

1.6.3 血漿細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13蛋白濃度檢測(cè) 采用雙抗體夾心ELISA：KD患兒及正常健康對(duì)照者空腹6 h后，取2 mL外周血，以肝素抗凝， 300×g離心15 min，移取上層血漿，-80℃保存?zhèn)溆茫桓鶕?jù)試劑盒(美國(guó)eBioscience公司，BMS225-2、BMS278、BMS231-3)說(shuō)明，檢測(cè)血漿細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13蛋白濃度。

1.6.4 Th2細(xì)胞比例及IL-4、pSTAT6、GATA-3蛋白水平檢測(cè) 采用流式細(xì)胞直標(biāo)法檢測(cè)：①取1 mL抗凝外周血，經(jīng)密度梯度離心法分離PBMC，按1×106·mL-1重懸于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基；②加入終濃度為1 μg·mL-1Ionomycin、300 ng·mL-1PMA和2 μmol·L-1Monensin，于5% CO2、37℃下刺激培養(yǎng)6 h；③經(jīng)CD4-eFluro450、IL-4-Alexa488、pSTAT6(Tyr641)-APC、GATA-3-PE-Cy7熒光標(biāo)記的單抗染色30 min后，采用Diva軟件分析CD4+IL-4+(Th2)細(xì)胞比例及CD4+T細(xì)胞IL-4、pSTAT6、GATA-3蛋白表達(dá)水平。其中，蛋白表達(dá)水平以平均熒光強(qiáng)度(MFI)表示。

表1 RT-PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

2 結(jié)果

2.1 一般情況 42例進(jìn)入本文分析，男22例、女20例，年齡1～5.3(2.9±1.3)歲；CAL亞組18例，男10例、女8例，年齡1～5.1(2.8±1.2)歲; NCAL亞組24例，男12例、女12例，年齡1～5.3(3.0±1.4)歲。健康對(duì)照兒童36例，其中男19例，女17例，年齡1.2～4.8(2.8±1.2)歲。年齡KD組和健康對(duì)照組(t=0.35,P=0.73)、CAL亞組和NCAL亞組(t=0.46,P=0.65)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，性別KD組和健康對(duì)照組(χ2=0.001,P=0.97)、CAL亞組和NCAL亞組(χ2=0.127,P=0.72)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 Th2細(xì)胞比例、功能相關(guān)分子及組蛋白甲基化相關(guān)分子表達(dá)檢測(cè) 表2和3顯示，與正常健康對(duì)照組相比，KD患兒急性期Th2細(xì)胞比例、功能相關(guān)分子IL-4、IL-5、IL-13 mRNA表達(dá)及血漿蛋白水平顯著增高(P<0.05)，其中CAL亞組均明顯高于NCAL亞組(P<0.05)，經(jīng)IVIG治療后明顯下降(P<0.05)，圖1為T(mén)h2細(xì)胞(A)及其相關(guān)分子(B)流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)束。

圖2顯示，各組IL-4基因組蛋白甲基化H3K4me3修飾變化，KD組IL-4基因CNS1、HSⅡ、HSVa位點(diǎn)組蛋白甲基化H3K4me3修飾水平顯著增加(P<0.05)，且CAL亞組CNS1、HSⅡ和HSVa位點(diǎn)H3K4me3修飾水平均高于NCAL亞組，經(jīng)IVIG治療明顯下調(diào) (P<0.05)。

表2 Th2細(xì)胞亞群及IL-4基因組蛋白甲基化相關(guān)分子流式檢測(cè)結(jié)果

注 1)：與對(duì)照組比較，P<0.05；2)：與NCAL組比較，P<0.05；3)：與KD組比較，P<0.05；KDIVIG組：IVIG治療后的KD組

表3 血漿細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)結(jié)果

注 1)：與對(duì)照組比較，P<0.05；2)：與NCAL組比較，P<0.05；3)：與KD組比較，P<0.05；KDIVIG組：IVIG治療后的KD組

圖1Th2細(xì)胞及相關(guān)分子流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

圖2IL-4基因組蛋白H3K4me3修飾及相關(guān)因子結(jié)合水平檢測(cè)結(jié)果

注 1)：與對(duì)照組比較P<0.05；2)：與NCAL組比較P<0.05；3)：與KD組比較P<0.05

表4 IL-4基因組蛋白甲基化相關(guān)分子熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

注 與Ctrl組比較，1)：P<0.05；與NCAL組比較；2)：P<0.05；與KD組比較；3)：P<0.05；KDIVIG組：IVIG治療后的KD組

2.3 IL-4組蛋白甲基化修飾相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白甲基化酶檢測(cè) 經(jīng)染色質(zhì)免疫共沉淀檢測(cè)IL-4基因組蛋白甲基化相關(guān)分子的結(jié)合水平，觀察到KD組外周血CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GATA3、組蛋白甲基化酶MLL1與IL-4基因CNS1、HSⅡ、HSVa位點(diǎn)的結(jié)合水平顯著上調(diào)(P<0.05)、且MLL1結(jié)合水平與IL-4基因mRNA表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.42、0.33、0.39,P<0.05)，經(jīng)IVIG治療后均表現(xiàn)不同水平的降低(P<0.05)。比較CAL亞組和NCAL亞組GATA3、MLL1與IL-4基因CNS1、HSⅡ、HSVa位點(diǎn)結(jié)合水平均明顯高于NCAL亞組 (P<0.05) 。

2.4 細(xì)胞因子IL-4信號(hào)相關(guān)分子及負(fù)性調(diào)節(jié)因子檢測(cè) KD患兒急性期血漿IL-4濃度、CD4+T細(xì)胞IL-4Rα、IL-2Rγ表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)，且CAL亞組IL-4濃度及IL-4Rα、IL-2Rγ表達(dá)均高于NCAL亞組(P<0.05)，經(jīng)IVIG治療后明顯下降(P<0.05)(表3和4)。進(jìn)一步分析IL-4R受體下游信號(hào)分子及負(fù)性調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，KD組CD4+T細(xì)胞pSTAT6、GATA3、SOCS5表達(dá)顯著上調(diào)，其中CAL亞組pSTAT6、GATA3表達(dá)高于NCAL亞組、SOCS5表達(dá)低于NCAL亞組(P<0.05)，經(jīng)IVIG治療后均表現(xiàn)出不同水平的降低(P<0.05)(表2和4)。

3 討論

KD是一種自身免疫性血管炎綜合征，其病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，可能與感染導(dǎo)致的急性自身免疫功能異常有關(guān)[1-3]，但導(dǎo)致KD自身免疫紊亂的機(jī)制仍未完全闡明。Th2細(xì)胞是一類(lèi)CD4+T細(xì)胞亞群，通過(guò)分泌IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子促進(jìn)B細(xì)胞成熟及抗體類(lèi)型轉(zhuǎn)換而介導(dǎo)體液免疫，并與多種自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[5-7]。本研究KD患兒急性期Th2細(xì)胞比例、功能相關(guān)因子IL-4、IL-5、IL-13 mRNA表達(dá)及血漿蛋白水平顯著增加，且CAL亞組前述各項(xiàng)指標(biāo)均明顯高于NCAL亞組，經(jīng)IVIG治療后顯著降低，提示Th2細(xì)胞數(shù)量及功能異?？赡芘cKD患兒免疫功能紊亂有關(guān)。

細(xì)胞因子IL-4不僅是Th2細(xì)胞的功能介導(dǎo)因子，還在調(diào)節(jié)其分化、成熟的分子機(jī)制中發(fā)揮著極為關(guān)鍵的作用[5, 6]。大量研究表明，多種因素如細(xì)胞因子信號(hào)、表觀遺傳學(xué)修飾等參與調(diào)節(jié)IL-4基因表達(dá)[8, 10, 11]。組蛋白甲基化是一種表觀遺傳學(xué)修飾方式，通過(guò)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶將甲基轉(zhuǎn)移至組蛋白中特定的氨基酸殘基，促使核小體外圍的染色質(zhì)絲發(fā)生空間構(gòu)象變化，進(jìn)而促進(jìn)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄活性。其中，H3K4me3修飾促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄[12-14]。本研究中， KD患兒急性期IL-4基因CNS1、HSⅡ、HSVa位點(diǎn)組蛋白甲基化H3K4me3修飾水平顯著增加，經(jīng)IVIG治療顯著降低。進(jìn)一步分析顯示，CAL亞組CNS1、HSⅡ和HSVa位點(diǎn)H3K4me3修飾水平均高于NCAL亞組，提示KD患兒急性期Th2 細(xì)胞數(shù)量及IL-4表達(dá)異?？赡芘c組蛋白H3K4me3過(guò)度修飾有關(guān)。

調(diào)節(jié)IL-4基因組蛋白甲基化的分子機(jī)制尚不完全清楚。GATA3是Th2細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可與IL-4基因CNS1、HSⅡ和HSVa位點(diǎn)結(jié)合并募集組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶MLL1，后者促使前述3位點(diǎn)發(fā)生組蛋白甲基化H3K4me3修飾，進(jìn)而增強(qiáng)GATA3介導(dǎo)的IL-4基因轉(zhuǎn)錄[10, 15]。本研究顯示，急性期KD患兒GATA3、MLL1與IL-4基因CNS1、HSⅡ、HSVa位點(diǎn)的結(jié)合水平顯著上調(diào)、且MLL1結(jié)合水平與IL-4基因mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，經(jīng)IVIG治療后均表現(xiàn)不同水平的降低。比較CAL亞組和NCAL亞組前述各項(xiàng)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)CAL亞組GATA3、MLL1與IL-4基因CNS1、HSⅡ、HSVa位點(diǎn)結(jié)合水平均明顯高于NCAL亞組，提示GATA3/MLL1過(guò)度結(jié)合可能是導(dǎo)致KD患兒急性期IL-4基因組蛋白H3K4me3修飾異常的重要原因。 IL-4可與靶細(xì)胞表面IL-4R(IL-4Rα/IL-2Rγ)結(jié)合，誘使JAK1/3發(fā)生磷酸化，激活JAK/STAT6信號(hào)途徑。JAK激酶磷酸化STAT6，后者形成二聚體并轉(zhuǎn)位入核，啟動(dòng)GATA3表達(dá)[16]。SOCS5負(fù)性調(diào)節(jié)JAK/STAT6信號(hào)，進(jìn)而抑制GATA3的表達(dá)[17]。為深入了解導(dǎo)致KD急性期患兒GATA3/MLL1與IL-4基因過(guò)度結(jié)合的調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究進(jìn)一步比較IL-4信號(hào)分子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)KD患兒急性期血漿IL-4濃度及細(xì)胞表面受體IL-4Rα、IL-2Rγ表達(dá)水平顯著增高，且CAL亞組IL-4濃度及IL-4Rα、IL-2Rγ表達(dá)均高于NCAL亞組，經(jīng)IVIG治療后均明顯下降。分析IL-4R受體下游信號(hào)分子及負(fù)性調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，注意到KD患兒急性期pSTAT6、GATA3、SOCS5表達(dá)顯著上調(diào)，其中CAL亞組pSTAT6、GATA3表達(dá)高于NCAL亞組、SOCS5表達(dá)則低于NCAL亞組，經(jīng)IVIG治療后表現(xiàn)出不同水平的降低，提示IL-4信號(hào)異常活化及負(fù)性調(diào)節(jié)因子SOCS5表達(dá)相對(duì)不足可能是導(dǎo)致KD患兒急性期GATA3/MLL1與IL-4基因過(guò)度結(jié)合的關(guān)鍵因素。

綜合上述結(jié)果，推測(cè)KD患兒急性期IL-4信號(hào)過(guò)度活化及負(fù)性調(diào)節(jié)因子SOCS5表達(dá)相對(duì)不足，促使轉(zhuǎn)錄因子GATA3過(guò)表達(dá)，后者與IL-4基因結(jié)合并募集組蛋白甲基化酶MLL1，介導(dǎo)IL-4基因組蛋白甲基化H3K4me3修飾水平及轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)，從而形成正反饋效應(yīng)及IL-4過(guò)度表達(dá)，最終導(dǎo)致Th2細(xì)胞數(shù)量及功能異常活化。但組蛋白甲基化是一種涉及多種信號(hào)及調(diào)節(jié)因子的復(fù)雜反應(yīng)，未來(lái)仍需進(jìn)一步研究是否存在其他因素參與調(diào)節(jié)IL-4基因組蛋白甲基化。