楊 艷 顧 遠 李 健 董 瑞 余發(fā)星, 董巋然

肝母細胞瘤(HB)是兒童最常見的肝臟惡性腫瘤[1-3]。其年發(fā)病率百萬人中1.2～1.5人，目前發(fā)病率仍在不斷上升[1]，發(fā)病機制目前尚不明確。順鉑是目前治療方案中主要的化療藥，但此藥對患兒有較大的不良反應(yīng)，具有耳毒性和腎毒性[4]。因此，分子靶向治療藥物的研發(fā)顯得尤為緊迫和重要。

近年研究發(fā)現(xiàn)，在肝母細胞瘤中同時存在著Hippo和Wnt通路的異常激活[5-10]。Hippo通路是一條進化及其保守的分子信號通路，對包括肝臟在內(nèi)的不同器官的大小控制有著深遠的影響，在肝臟腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[11-13]。Wnt通路是多細胞生物發(fā)育過程中重要信號通路[14]。YAP和β-catenin分別為Hippo和Wnt通路的關(guān)鍵效應(yīng)分子，約79%的肝母細胞瘤樣本中，可發(fā)現(xiàn)二者同時在核內(nèi)高表達[10]，提示兩條通路在肝母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。在小鼠動物模型中，YAP和β-catenin基因表達快速導(dǎo)致HB的發(fā)生和發(fā)展[10]。因此，YAP和β-catenin在HB的發(fā)生發(fā)展過程中至關(guān)重要，而抑制YAP和β-catenin活性是HB治療的新思路。

Tankyrase 1和2(TNKS1/2)是聚二磷酸核糖聚合酶(PARP)的組成成分，又稱PARP5a/b。TNKS1/2可誘導(dǎo)AMOT和AXIN1核糖基化(PARylation)，進而觸發(fā)E3連接酶RNF146介導(dǎo)的泛素化以及蛋白酶體介導(dǎo)的降解[15-20]。AMOT和AXIN1分別是YAP和β-catenin的負調(diào)因子，因此TNKS1/2的活性與YAP和β-catenin呈正相關(guān)。XAV939是一種TNKS1/2的小分子抑制劑，能夠穩(wěn)定AMOT和AXIN1的活性，繼而使YAP和β-catenin失活。因此，XAV939有潛力成為HB治療的先導(dǎo)藥物。

1 方法

1.1 研究路線 本研究旨在探討TNKS1/2抑制劑XAV939在HB發(fā)生發(fā)展過程中的功能。圖1顯示，檢測YAP和β-catenin在中國HB患兒腫瘤組織標本中的活化狀態(tài)，進而在HB細胞中檢測XAV939對YAP和β-catenin的抑制作用，同時構(gòu)建HB小鼠PDX，并在HB PDX模型上檢測XAV939對HB發(fā)生發(fā)展的作用。

圖1 研究總體設(shè)計及路線圖

1.2 倫理和知情同意 本研究方案獲復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)倫理委員會批準，所有研究對象的法定監(jiān)護人均簽署知情同意書。

1.3 免疫組化染色(IHC)標本 選取HB患兒腫瘤及瘤旁肝臟組織標本，福爾馬林固定后進行切片，行蘇木精和伊紅(H&E)染色，觀察腫瘤組織學(xué)亞型和腫瘤分級；同時進行IHC實驗，檢測目標抗體在腫瘤及瘤旁組織中的表達情況。

1.4 細胞實驗 HuH6細胞培養(yǎng)在在含10%胎牛血清(Gibco)和50μg·mL-1的雙抗(青霉素/鏈霉素)DMEM中，置于5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中。XAV939和olaparib均購買自Selleck，并根據(jù)其說明劑量用于細胞實驗。

1.5 建立PDX模型 實驗所用小鼠為8周齡的雌鼠，購自斯萊克實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于SPF清潔級環(huán)境中。選取確診為HB并予以手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織，將其切分成0.5 cm×0.5 cm的組織塊，用生理鹽水沖洗后，迅速移植到裸鼠皮下。當(dāng)腫瘤生長到1～2 cm3時(腫瘤體積=長徑×短徑2/2，數(shù)值由游標卡尺計量，精確到0.1 cm)，處死裸鼠，取下腫瘤塊按照上述方法進行傳代或快速冷凍保存。將獲取到的PDX腫瘤組織進行H&E染色和IHC染色，以檢測其與原代腫瘤組織的保真度。

1.6 PDX模型的藥物實驗 ①順鉑和XAV939藥物試驗：腹腔內(nèi)注射給藥，將PDX小鼠分為空白組(生理鹽水)、順鉑(每周3 mg·kg-1)、XAV939(每天2 mg·kg-1)和順鉑+XAV939組(劑量同單獨順鉑和XAV939)；②索拉非尼和瑞格菲尼藥物試驗：將PDX小鼠分為空白組(腹腔內(nèi)注射生理鹽水)、順鉑(每5天腹腔內(nèi)注射1次，每次3 mg·kg-1)、索拉非尼(經(jīng)口給藥，每天40 mg·kg-1，連續(xù)給藥5 d后，每2天給藥一次，至15天)和瑞格菲尼(經(jīng)口給藥，每天20 mg·kg-1，至15天)。實驗期間，每日記錄PDX小鼠皮下腫瘤大小和小鼠體重。實驗結(jié)束時取腫瘤組織，測量腫瘤重量，測小鼠血清中AFP濃度。

1.7 IHC HB腫瘤、癌旁組織及PDX腫瘤組織的石蠟切片及H&E染色均由武漢谷歌生物科技有限公司完成，其中部分切片被用來行IHC實驗，實驗方法參考文獻[22]。將石蠟切片運用二甲苯、濃度梯度酒精脫蠟后，使用檸檬酸鈉封閉抗原氧化物15 min，再用3%羊血清(3% BSA/PBS配制)封閉1 h，然后滴加上一抗放入濕盒中，靜置于4℃冰箱過夜。第2日滴加二抗(anti-rabbit HRP, Dako, K4003)孵育2 h，用GTVision Ⅲ IHC detection kit (GK500705; GeneTech)顯色。最后用濃度梯度酒精和二甲苯逐步脫水封片，晾干后于光鏡下拍照。YAP (14074; 1∶100稀釋) 和β-catenin(8480; 1∶100稀釋) 抗體購買于CST(Cell Signaling Technology), AFP(ab169552; 1∶100 稀釋) 購買于Abcam。β-catenin的染色強度設(shè)定為4級，4為最強，1為最弱，1：膜定位，2：胞質(zhì)普遍表達，3：核內(nèi)弱表達，4：核內(nèi)強表達:。YAP在組織細胞中的染色強度分為4級，4為最強，1為最弱，1：無表達，2：弱表達，3：胞內(nèi)高表達、核內(nèi)弱表達，4：胞內(nèi)高表達、核內(nèi)強表達。

1.8 蛋白印跡實驗(WB) 蛋白印跡實驗參考文獻[23]。所使用的一抗如下：YAP (14074; 1∶1 000 稀釋), p-YAP (S127, 4911; 1∶1 000 稀釋), AXIN1(2087; 1∶1 000 稀釋), Active β-catenin (8814; 1∶1 000 稀釋), Vinculin (13901; 1∶3 000 稀釋)，以上抗體均購于CST；AMOT (A303-305A; 1∶1 000 稀釋) 購買于Bethyl Laboratories, CYR61 (sc-13100; 1∶500 稀釋) 購買于Santa Cruz Biotechnology, β-catenin (610154; 1∶2 000 稀釋) 購買于BD Biosciences, AXIN2 (PA5-25331; 1∶1 000 稀釋) 購買于Invitrogen。

1.9 定量RT-PCR 提取總RNA的試劑盒為Takara MiniBEST universal RNA Extrction kit，cDNA由TransScript First-Strand cDNA synthesis kit (TransGen Biotech)合成，qPCR實驗系統(tǒng)為SYBR Green qPCR Master Mix (TaKaRa) on 7500 fast and 7500 Real-Time PCR systems (Applied Biosystems)。引物序列參考參考文獻[23-25]。

1.10 數(shù)據(jù)分析 統(tǒng)計分析采用單因素方差分析或雙因素方差分析。P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β-catenin和YAP在HB患兒的病理標本中激活 選取2014至2017年在我院病理確診的20例HB患兒腫瘤及瘤旁肝臟組織標本(表1)。圖2A顯示，根據(jù)IHC染色結(jié)果，將β-catenin和YAP的染色情況分為4級別(其中1為膜定位/無表達， 4為核內(nèi)強表達/胞內(nèi)高表達、核內(nèi)強表達，2和3介于二者之間)。在正常肝臟組織中，β-catenin主要在肝細胞的細胞連接處表達，YAP在肝細胞中表達較弱，在膽管細胞中表達較強(箭頭所示)。圖2B和C顯示，在HB組織中，β-catenin和YAP的表達均顯著升高，幾乎所有腫瘤組織出現(xiàn)β-catenin和YAP的細胞核染色。同時，β-catenin和YAP的活化程度在不同的HB樣本中呈高度正相關(guān)(圖2D)。

2.2 XAV939抑制HB細胞中β-catenin和YAP活性 為了測試抑制TNKS1/2是否能調(diào)節(jié)HB細胞中Wnt和Hippo通路，使用了tankyrase抑制劑XAV939或PARP1抑制劑Olaparib處理Huh6細胞。XAV939處理后的細胞中AMOT(130 kDa亞型)和AXIN1的表達水平有所升高；相反，YAP磷酸化(蛋白失活)有所增加，β-catenin蛋白非磷酸化(蛋白活化)水平降低。此外，在XAV939處理的細胞中，YAP和β-catenin的靶蛋白CYR61和AXIN2的表達水平均降低(圖3A)。在mRNA水平， YAP的3個靶基因(ANKRD1,CTGF, 和CYR61)和β-catenin的2個靶基因(AXIN2和LGR5)在XAV939處理的細胞中表達顯著下降(～50%,P<0.01)(圖3B)。Olaparib處理的細胞中YAP和β-catenin靶基因表達沒有明顯變化(圖3，P>0.05)。結(jié)果表明，XAV939能夠在HB細胞中特異抑制YAP 及β-catenin，具有抑制HB發(fā)生發(fā)展的潛力(圖3C)。

2.3 肝母細胞瘤PDX模型的建立 選取2017年5～11月我院11例確診為HB并予以手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織，行PDX模型構(gòu)建，最終成功建立了4例PDX模型，其中2例可在冷凍保存后進行復(fù)蘇再次在裸鼠皮下成瘤(表2)。87號患兒的腫瘤組織同瘤旁正常組織相比，其YAP、β-catenin和AFP的表達高于后者(圖4)。在第1～3代所收集的PDX腫瘤組織中，可見腫瘤細胞形態(tài)與原發(fā)腫瘤一致，而在PDX腫瘤組織中YAP、β-catenin和AFP的表達略高。 HB PDX能夠很好地模擬原發(fā)HB病理形態(tài)，是檢測HB候選藥物療效的良好工具。

表1 20例HB患兒腫瘤及瘤旁肝臟組織標本

注 腫瘤依據(jù)Pre-TEXT 標準分級

圖2YAP及β-catenin在HB樣本中活化情況

注 A：HB腫瘤及癌旁組織中YAP及β-catenin表達水平及亞細胞定位。根據(jù)染色強度及細胞核定位將YAP及β-catenin表達水平分為四級，1-4級分別代表低到高的蛋白表達水平及細胞核定位。箭頭指示膽管。比例尺：20 μM?？瞻滋帥]有對應(yīng)樣本。B：HB中β-catenin活化(t檢驗，P<0.000 1)。 C：HB中YAP活化(t檢驗，P<0.000 1)。D：HB中β-catenin及YAP活化水平呈正相關(guān)，黑圈大小代表樣本數(shù)量(對應(yīng)右方數(shù)字)，r=0.4233，P=0.03

圖3TNKS1/2抑制劑XAV939對YAP及β-catenin活性的抑制

注 A：XAV939處理Huh6細胞后，AMOT p130及AXIN1蛋白穩(wěn)定性上升，YAP及β-catenin失活，靶向基因CYR61及AXIN2表達水平下降.PARP1抑制劑Olaparib無顯著效應(yīng)。B：XAV939抑制YAP及β-catenin靶向基因mRNA表達。C：XAV939治療HB機制設(shè)想。XAV939抑制TNKS1/2,導(dǎo)致AMOT及AXIN1上升，YAP及β-catenin失活，從而抑制HB發(fā)生發(fā)展

表2 PDX相關(guān)病例信息及PDX構(gòu)建情況

2.4 不同藥物對HB PDX腫瘤生長的影響 ①順鉑和XAV939藥物試驗：將87號患兒所建立的PDX模型行傳代擴增至第5代時共產(chǎn)生16只PDX小鼠，隨機將PDX小鼠分配至空白組、順鉑組、XAV939組和順鉑+XAV939組，每組各4只，至24 d時處死PDX小鼠取下腫瘤組織；②索拉非尼和瑞格菲尼藥物試驗：87號患兒所建立的PDX模型行傳代擴增至第9代時共產(chǎn)生20只PDX小鼠，隨機將PDX小鼠分配至空白組、順鉑組、索拉非尼組和瑞格菲尼組，每組各5只。藥物實驗為期15 d時處死PDX小鼠取下腫瘤組織。

順鉑和XAV939藥物試驗：圖5A～C顯示，順鉑和XAV939藥物試驗中，順鉑組和順鉑+XAV939組與空白組和XAV939組比較，腫瘤生長抑制作用強(P<0.05)、血漿AFP水平低(P<0.05)，小鼠體重增長少；圖5D顯示，順鉑組和順鉑+XAV939組比空白組和XAV939組腫瘤重量增長少(P<0.05)，需要說明的是，圖5A顯示的空白組和XAV939組較順鉑組和順鉑+XAV939組有更好體重表現(xiàn)，是因為空白組和XAV939組腫瘤重量占據(jù)了體重的比例更多；圖5A～C也顯示，順鉑組較順鉑+XAV939組在腫瘤生長抑制作用、血漿AFP水平和小鼠體重增長差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明順鉑+XAV939無協(xié)同作用。

索拉非尼和瑞格菲尼藥物試驗：圖5E顯示，腫瘤組織重量方面，順鉑組、索拉非尼組和瑞格菲尼組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，索拉非尼組和瑞格菲尼組與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，僅順鉑組與空白組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

Hippo和Wnt通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。而YAP和β-catenin在HB中的異常激活的發(fā)現(xiàn)，提示這兩條通路或可成為HB的治療靶點。由于TNKS1/2抑制劑已被證明能有效抑制YAP和β-catenin的活性，因此，檢測TNKS1/2抑制劑對HB的作用效應(yīng)則顯得尤為重要。

本研究發(fā)現(xiàn)YAP和β-catenin在中國HB患兒中同時被異常激活，但未檢測到β-catenin和YAP的表達與腫瘤分級的相關(guān)性，推測可能與本次研究的HB樣本數(shù)量較少有關(guān)。Huh6細胞最初由一位日本學(xué)者從一位1歲的日本男性肝母細胞瘤患兒的腫瘤標本中分離培養(yǎng)而來，為研究歷史最久的一株細胞系，也是目前唯一可用的HB細胞系[26]。本研究在細胞實驗部分，證實了TNKS1/2抑制劑，即XAV939，有效地抑制了HB細胞系HuH6中YAP和β-catenin的活性。隨后建立的HB的PDX腫瘤模型，保留了HB原發(fā)腫瘤的組織學(xué)和分子生物學(xué)特性，并且檢測到PDX腫瘤的生長能被順鉑有效抑制，順鉑是目前用于HB化療的基礎(chǔ)用藥。索拉非尼和瑞格菲尼現(xiàn)主要用于治療成人肝細胞癌(HCC)，屬于激酶抑制劑，也表現(xiàn)出了一定的腫瘤生長抑制作用，尤其是索拉非尼，但結(jié)果不具有統(tǒng)計學(xué)意義，推測主要是由于實驗的樣本數(shù)量有限所致(圖5E)。然而，本研究建立的PDX模型中，XAV939未能抑制腫瘤的生長，表明XAV939不是治療HB的理想候選者。

圖4原代腫瘤及PDX腫瘤H&E及IHC染色

注 HBC87: 87號肝母細胞瘤腫瘤標本，HBP87：87號肝母細胞瘤瘤旁正常肝臟組織標本，P1、P2及P3分別代表第1～3代對應(yīng)PDX組織。從H&E及AFP染色可以看出，原代腫瘤及PDX腫瘤二者均表現(xiàn)為核嗜堿性、核大深染、胞質(zhì)少、胞質(zhì)嗜堿性、AFP陽性等病理特性。YAP、β-catenin的IHC染色可見原代腫瘤及PDX腫瘤均有強染色反應(yīng)，表示組織中存在著Hippo通路和Wnt通路的異常激活。 比例尺：20 μm

XAV939對PDX腫瘤的生長影響不明顯，可能由諸多原因所致。首先， XAV939在小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)尚不清楚。本研究采用的腹腔注射法可能無法有效地將XAV939運送至腫瘤。本研究未檢測到XAV939組的腫瘤組織中AMOT和AXIN1濃度的顯著升高，表明XAV939可能未至腫瘤組織中。在未來的研究中可嘗試其他具有更好在體表現(xiàn)的TNKS1/2抑制劑進行PDX藥物實驗。其次，XAV939在實體腫瘤內(nèi)可能無法穩(wěn)定AMOT和AXIN1。此前大多數(shù)與XAV939相關(guān)的研究均在體外細胞系中進行，而其在體實驗的相關(guān)研究則相對缺乏。因此，今后需要對XAV939的在體實驗進行更為充分的研究。

圖5XAV939及其他藥物對HBPDX生長的作用

注 PDX后隨機分為對照及藥物處理組：空白組，XAV939組(2 mg·kg-1，每天1次，腹腔注射)、順鉑組(3 mg·kg-1，每周1次，腹腔注射)及XAV939+順鉑組。本次藥物實驗為期24 d，至實驗結(jié)束時，無小鼠異常死亡。A：小鼠體重，B：PDX腫瘤體積，C：PDX腫瘤試驗終點時重量，D：小鼠血清AFP水平，E：本次藥物實驗分為空白對照組，順鉑組(3 mg·kg-1，5天1次，腹腔注射), 索拉非尼組(40 mg·kg-1，每天1次，經(jīng)口喂養(yǎng)，連續(xù)喂養(yǎng)5天后改為2天1次)及瑞格菲尼組(20 mg·kg-1，每天1次，經(jīng)口喂養(yǎng))。本次藥物實驗為期15 d，至實驗結(jié)束時，索拉非尼組小鼠死亡3只

Hippo和Wnt通路參與HB的發(fā)生發(fā)展由小鼠基因遺傳數(shù)據(jù)所支持，因此這兩條通路仍然被認為是HB的治療靶點[10]。然而，對于TNKS1/2、AMOT家族蛋白和AXIN1，他們對HB發(fā)生的影響有待于用遺傳模型進一步闡明。最后，通過本研究，可以證實PDX模型是一種可靠的臨床前藥物檢測方法，可以用此模型進行HB靶向藥物篩查。