張忠勝 劉雙鳳 黃四春

腦缺血損傷指由于腦血循環(huán)障礙引起的局灶性或全腦缺血和缺氧所致的神經(jīng)功能缺損[1]。腦缺血時(shí)，多種原因使得腦細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，造成線(xiàn)粒體損傷，導(dǎo)致三磷酸腺苷生成減少，能量代謝障礙，同時(shí)產(chǎn)生大量的自由基可進(jìn)一步加重腦組織損害，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[2]。胸腺素β4最初從胸腺中分離純化獲得，在體內(nèi)廣泛分布，是胸腺肽家族成員之一[3]。胸腺素β4由43個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，研究結(jié)果表明，胸腺素β4可通過(guò)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞分化與遷移從而促進(jìn)血管生成和創(chuàng)傷愈合[4]。在糖尿病大鼠的損傷模型中，使用胸腺素β4治療后的第4天，血管再生最強(qiáng)[5]。胸腺素β4能增加梗死心肌的微血管密度，促進(jìn)梗死后微血管形成，提高血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)[6]。胸腺素β4對(duì)卒中的保護(hù)作用也有報(bào)道[7-8]，但其潛在作用機(jī)制尚未得到證實(shí)。因此，本研究采用體外培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞，通過(guò)氧糖剝奪-復(fù)氧法模擬缺血-再灌注損傷，使用外源性胸腺素β4作用于氧糖剝奪-復(fù)氧損傷大鼠的皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞，旨在研究胸腺素β4對(duì)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞氧糖剝奪-復(fù)氧損傷的影響，并評(píng)估其作用機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)新生48 h內(nèi)SD大鼠乳鼠，雌雄不限,體質(zhì)量5～7 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)(2016-0002)。大鼠生長(zhǎng)環(huán)境：溫度 20～25 ℃，濕度約50%；室內(nèi)風(fēng)速控制于0.1～0.2 m/s。光照：12 h照明與12 h黑暗交替。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

NeurobasalTM培養(yǎng)基(21103049，美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(26400-036,美國(guó)Gibco公司)； Hank′s平衡鹽溶液(14065-056，美國(guó)Gibco公司)；磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS，14190136，美國(guó)Gibco公司)；牛血清白蛋白(A8010-5，美國(guó)Solarbio公司)；胰蛋白酶(25200072，美國(guó) Gibco公司)；Lipofectamine? 3000試劑(美國(guó)invitrogen公司，18882752)；b-27TM Supplement(50X)(美國(guó)Gibco公司 17504044)；胸腺素β4(MCE HY-P0029，美國(guó)CLOUD-CLONE CORP公司)；CCK-8 (cell counting Kit-8)試劑(96992-500TEST，美國(guó)Sigma公司)；β-神經(jīng)生長(zhǎng)因子(SB 50385-MNAC，美國(guó)Gibco公司)；L-谷氨酰胺(G0200，北京索萊寶科技有限公司)；兔抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)多克隆抗體(bs-10445R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶脫氧尿苷三磷酸缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase deoxyuridine triphosphate nick end labeling，TUNEL)檢測(cè)試劑盒(C1088，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(annexin V-fluoresceine isothiocyanate/propidum lodide,Annexin V-FITC/PI) 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(AP101-100-kit，中國(guó)MULTI SCIENCES 聯(lián)科生物)；PI(C1062，Beyotime，寧波)；Trizon試劑(CW0580S，中國(guó)康為世紀(jì)生物科技有限公司)；UltraSYBR Mixture(CW0957M，中國(guó)康為世紀(jì)生物科技有限公司)；RIPA細(xì)胞裂解液(C1053，北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；PVDF膜(IPVH00010， 美國(guó)Millipore公司)；超敏發(fā)光液(RJ239676，美國(guó)賽默飛公司)；兔多克隆抗胸腺素β4(DF12334，美國(guó)Affinity公司)；兔多克隆抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78,YT5858，美國(guó)ImmunoWay公司)；兔多克隆抗CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer binding prolein,C/EBP)同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP,ab179823，英國(guó)Abcam公司)；兔多克隆抗Bax(ab32503，英國(guó)Abcam 公司)；鼠單克隆抗B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2,bsm-33047M，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。酶標(biāo)儀(Rayto RT6000，美國(guó)Rayto公司)；Microplate Reader(Thermo，美國(guó))；熒光顯微鏡(CKX53，日本OLYMPUS公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；NovoCyteTM流式細(xì)胞儀[NovoCyte 2060R，艾森生物(杭州)有限公司]；蛋白垂直電泳儀(DYY-6C，北京市六一儀器廠(chǎng))；超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)[Chemi DocTM XRS+，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司]；ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 分離大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞

將出生48 h內(nèi)的大鼠乳鼠處死，采用75%乙醇消毒后，應(yīng)用眼科剪剪開(kāi)大鼠顱骨，眼科鑷夾取腦組織置于預(yù)先冰浴處理 的Hank′s平衡鹽溶液中。剝?nèi)テべ|(zhì)表面的腦膜及血管，快速將腦組織移入另一盛有預(yù)冷Hank′s平衡鹽的培養(yǎng)皿中，將腦組織剪成大小約1 mm3的碎塊，加入0.125%胰蛋白酶后，37 ℃水浴振蕩消化10～15 min后，吸去胰蛋白酶，采用PBS洗滌2次后，加入配制的培養(yǎng)基(Neurobasal培養(yǎng)基+FBS)+B27 Supplement+β-神經(jīng)生長(zhǎng)因子+ L-谷氨酰胺，吹打成細(xì)胞懸液。通過(guò)70 μm篩網(wǎng)過(guò)濾后，離心(1 000 r/min，離心半徑為5 cm，離心5 min)，加入上述配制的新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞懸液，鋪板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 免疫熒光

在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的培養(yǎng)皿(培養(yǎng)7 d)用PBS浸洗3次，每次3 min； 用4%多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗培養(yǎng)皿3次，每次3 min；0.5%Triton X-100( PBS配制 )室溫通透20 min；PBS浸洗培養(yǎng)皿3次，每次5 min，吸干PBS，在培養(yǎng)皿內(nèi)滴加5%牛血清白蛋白37 ℃封閉30 min。培養(yǎng)皿內(nèi)滴加稀釋好的一抗NSE(1∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜。PBS浸洗培養(yǎng)皿3次，每次3 min，吸干培養(yǎng)皿內(nèi)多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗FITC(1∶100)，37 ℃孵育30 min，PBS浸洗培養(yǎng)皿3次，每次3 min；滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行核染，應(yīng)用PBS沖洗多余的DAPI；應(yīng)用50%甘油封閉培養(yǎng)皿，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.5 篩選藥物濃度

細(xì)胞鋪板，選擇胸腺素β4濃度分別為0、0.1、1、10、100、1 000、10 000 μg/L 。細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，加入胰蛋白酶消化2～3 min，加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞吹打下來(lái)并吸取至10 ml離心管中，離心(轉(zhuǎn)速1 000 r/min，離心半徑11 cm，離心時(shí)間5 min)，棄上清液，加入上述配制的培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)，細(xì)胞密度為8 000個(gè)/孔。按上述濃度分組，并接種至96孔板中待細(xì)胞貼壁后，加藥處理48 h，將待測(cè)的96孔板細(xì)胞換成相同的培養(yǎng)基，每孔100 μl，每孔加入10 μl CCK-8 試劑，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h；酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的吸光度值。

1.6 氧糖剝奪-復(fù)氧制作細(xì)胞缺血-再灌注模型與實(shí)驗(yàn)分組

氧糖剝奪6 h，復(fù)氧12 h制作細(xì)胞模擬缺血-再灌注損傷模型[9]。取培養(yǎng)7 d的皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞，吸去原培養(yǎng)液，清洗后加入無(wú)糖 Earle′s液，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于缺氧罐內(nèi)，向罐內(nèi)持續(xù)通入含有95%N2和5%CO2的混合氣體。通氣30 min后夾閉缺氧罐的進(jìn)出口，置于培養(yǎng)箱內(nèi)密閉6 h，取出缺氧罐，吸去無(wú)糖Earle′s液，換回維持培養(yǎng)液，放回37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)組分為對(duì)照組、模型組(氧-糖剝奪6 h，復(fù)氧12 h)和治療組(10 μg/L胸腺素β4)。對(duì)照組(含糖Earle′s液)始終在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃、5%CO2)。治療組建模前2 h加入濃度為10 μg/L 的胸腺素β4。

1.7 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力

當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%匯合時(shí)，用外源性胸腺素β4處理48 h。48 h后，通過(guò)CCK-8測(cè)定檢測(cè)細(xì)胞活力[10]。將晶體溶解在二甲基亞砜中，在Microplate Reader上以450 nm的波長(zhǎng)測(cè)量吸光度。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

用胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞。將細(xì)胞與annexin V-FITC和PI在黑暗中孵育30 min后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，并通過(guò)NovoCyteTM流式細(xì)胞儀分析數(shù)據(jù)。

1.9 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS洗滌3次(每次3 min)并在4%多聚甲醛中固定15 min。用PBS洗滌3次后，將細(xì)胞與0.5%Triton X-100(PBS制劑)在室溫下孵育20 min，PBS浸洗培養(yǎng)皿3次，每次3 min。吸去細(xì)胞培養(yǎng)皿中的PBS，加入TUNEL檢測(cè)液，45 ℃避光孵育2 h。滴加DAPI避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，應(yīng)用PBS沖洗多余的DAPI；應(yīng)用50%甘油封閉培養(yǎng)皿，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.10 Western blotting測(cè)定蛋白表達(dá)

從細(xì)胞中收集蛋白質(zhì)用于蛋白質(zhì)印跡[11]。使用蛋白質(zhì)分離試劑盒提取蛋白質(zhì)，并使用二辛可寧酸試驗(yàn)試劑盒定量。將20 μg蛋白質(zhì)加載到泳道中，通過(guò)12%凝膠上的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。室溫下在5%脫脂乳中封閉2 h后，將膜與下列一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜：兔多克隆抗胸腺素β4、兔多克隆抗GRP78、兔多克隆抗CHOP、兔多克隆抗Bax、鼠單克隆抗Bcl-2。將硝酸纖維素膜洗滌3次，并與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗在4 ℃下孵育2 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑盒顯現(xiàn)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，并使用ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)掃描印跡。利用Image J軟件進(jìn)行光密度分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞分離及鑒定結(jié)果

體外培養(yǎng)7 d大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞，分支連接成明顯的網(wǎng)絡(luò)(圖1)。皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞中可見(jiàn)NSE表達(dá)(圖2)，說(shuō)明皮質(zhì)細(xì)胞分離正確。

2.2 CCK-8檢測(cè)不同濃度胸腺素β4亞組細(xì)胞活力

如圖3所示，與對(duì)照組比較，10 μg/L 胸腺素β4組作用的細(xì)胞活力明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032)。因此選擇濃度10 μg/L胸腺素β4進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著下降(P=0.002)；治療組(10 μg/L外源性胸腺素β4)細(xì)胞活力明顯高于模型組(P=0.008)，見(jiàn)圖4 。

2.3 胸腺素β4抑制氧糖剝奪-復(fù)氧法誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡

如圖5～8所示，模型組細(xì)胞凋亡明顯高于對(duì)照組(P<0.01)；與模型組比較，治療組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P=0.002)。

2.4 胸腺素β4改善氧糖剝奪-復(fù)氧法誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)

如圖9所示，與對(duì)照組比較，模型組的GRP78、CHOP、Bax表達(dá)明顯升高(P值分別為0.034、0、0.045)，Bcl-2的表達(dá)明顯下降(P=0.006)；與模型組比較，治療組的GRP78、CHOP、Bax表達(dá)明顯下降(P值分別為0.032、0.027、0.019)，Bcl-2表達(dá)明顯升高(P=0.028)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

本研究利用原代分離大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞并體外培養(yǎng)，采用氧糖剝奪-復(fù)氧法建立模擬缺血-再灌注模型，利用大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞NSE蛋白，通過(guò)免疫熒光法鑒定，結(jié)果顯示細(xì)胞分離成功。胸腺素β4有多種功能，可促進(jìn)血管再生、神經(jīng)軸突修復(fù)[12]、抑制炎性反應(yīng)[13]，是治療腦缺血后“血管神經(jīng)單元”修復(fù)和再生的最佳選擇之一[14]。有研究表明，心肌梗死后胸腺素β4的表達(dá)增高能抑制心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心臟功能恢復(fù)[15]。局灶性腦缺血和全腦缺血后海馬部位均有胸腺素β4 表達(dá)增加[16]。向局灶性腦缺血模型的大鼠腹腔注射合成的胸腺素β4多肽后，發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血半暗帶區(qū)的血管密度增加，神經(jīng)軸突修復(fù)增多，大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)加快[17]。本研究結(jié)果表明，利用外源性胸腺素β4能改善氧糖剝奪-復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這也與上述結(jié)果一致。

細(xì)胞凋亡是缺血-再灌注損傷的主要形式之一[18]。Bcl-2家族成員在凋亡過(guò)程中扮演著關(guān)鍵作用[19]。Bcl-2是最重要的抗凋亡蛋白，主要位于線(xiàn)粒體外膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等部位，在細(xì)胞調(diào)控中，其可以阻斷細(xì)胞色素C釋放至胞質(zhì)，抑制下游的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[20]。而促凋亡蛋白Bax位于細(xì)胞質(zhì)中，其通過(guò)與Bcl-2的同源結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成異源二聚體，阻斷Bcl-2活性，促進(jìn)細(xì)胞色素C穿過(guò)線(xiàn)粒體膜，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[21]。Bcl-2家族通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax的平衡來(lái)維持線(xiàn)粒體的穩(wěn)定[22]。因此，抗凋亡Bcl-2和促凋亡Bax的比例對(duì)細(xì)胞存活起到重要作用。已有研究報(bào)道，在腦缺血模型中，Bcl-2表達(dá)減少而B(niǎo)ax表達(dá)增加[23]。本研究結(jié)果表明，大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)模擬建立缺血-再灌注模型后，Bcl-2表達(dá)水平下降，Bax表達(dá)水平升高，經(jīng)胸腺素β4干預(yù)后，Bcl-2表達(dá)水平升高和Bax表達(dá)水平下降，與之前的報(bào)道一致。

GRP78屬于熱休克蛋白70家族的一員，是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中最多的伴侶蛋白。在生理情況下，GRP78的表達(dá)處于較低的基礎(chǔ)水平，其主要功能是參與新生多肽鏈的折疊、裝配和轉(zhuǎn)運(yùn)；在缺血缺氧、低血糖、氧化應(yīng)激、鈣離子失衡等不利環(huán)境應(yīng)激下，大量多肽鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)變性、積聚，GRP78表達(dá)量明顯增高[24]。研究表明，在腎臟、腦、視網(wǎng)膜等組織缺血-再灌注的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，GRP78表達(dá)均上調(diào)[25]。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保護(hù)性伴侶蛋白表達(dá)的上調(diào)可以緩解多種組織的缺血損傷，在小鼠腦、肺、腎、心肌、視網(wǎng)膜缺血模型及人肝細(xì)胞癌移植瘤等實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)，缺血可導(dǎo)致GRP78等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白表達(dá)顯著增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保護(hù)伴侶蛋白表達(dá)和活性的上調(diào)可以刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，因而緩解了細(xì)胞損傷[26-28]。CHOP是一個(gè)堿性亮氨酸拉鏈(b-zip)轉(zhuǎn)錄因子，屬于CCAAT增強(qiáng)子相連蛋白的轉(zhuǎn)錄因子C/EBP 家族[29]。正常情況下，CHOP 表達(dá)較低，而在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，CHOP表達(dá)明顯升高，過(guò)度表達(dá)的CHOP促使細(xì)胞周期停滯或凋亡，而CHOP-/-則可保護(hù)細(xì)胞，避免細(xì)胞凋亡[30]。本研究結(jié)果表明，模型組GRP78和CHOP的表達(dá)水平明顯升高，這也與上述結(jié)果一致；通過(guò)胸腺素β4干預(yù)后，GRP78和CHOP的表達(dá)水平明顯下降，表明胸腺素β4能夠改善缺血損傷引起的細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明，胸腺素β4可能通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)缺血-再灌注損傷的應(yīng)激反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)GRP78、CHOP、Bcl-2、Bax等蛋白的表達(dá)，并最終改善缺血-再灌注損傷。

綜上所述，缺血-再灌注損傷可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而引起GRP78、CHOP、Bax等蛋白表達(dá)水平升高，最終誘導(dǎo)調(diào)亡的發(fā)生，而胸腺素β4能夠改善氧糖剝奪-復(fù)氧誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴(lài)性細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果為胸腺素β4在腦缺血-再灌注損傷治療中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。