張紅宇 李 娟 余祖江 江河清 梁紅霞 武淑環(huán)

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染性疾病科 (河南 鄭州， 450052)

肝細胞癌在常見腫瘤的發(fā)病率中排第5位，同時也是和癌癥相關(guān)死亡的第三大病因[1]。目前肝細胞癌的臨床預(yù)后仍然較差，3年內(nèi)復(fù)發(fā)率可高達50%[2]。 除腫瘤病變的異質(zhì)性外，還與肝細胞癌主要由慢性病毒性肝炎或肝硬化導(dǎo)致相關(guān)[3]。肝纖維化是由各種慢性肝損傷引起的病理變化的結(jié)果。由于持續(xù)的肝細胞損傷、炎癥、壞死、異常增殖和細胞外基質(zhì)(ECM)膠原沉積，慢性肝炎的發(fā)生最終導(dǎo)致肝硬化[4，5]。然而，肝細胞癌發(fā)展過程中ECM膠原沉積的重要性尚未得到充分證實。脯氨酰4-羥化酶亞基α-1(P4HA2)是膠原生物發(fā)生的關(guān)鍵酶。miRNA通過與靶mRNA內(nèi)的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)結(jié)合而影響真核細胞中基因表達的調(diào)節(jié)。通過調(diào)節(jié)靶基因的表達，miRNA參與多種生物過程，包括細胞增殖、分化和凋亡的過程[6]。 先前的證據(jù)表明miR-495在肝細胞癌中的表達較癌旁正常的肝組織顯著下調(diào)[7]。然而，miR-495在肝細胞癌中的作用知之甚少。我們研究了miR-495和P4HA2在肝硬化和肝癌細胞發(fā)生中的作用，發(fā)現(xiàn)miR-495可以通過直接靶向P4HA2 mRNA 的3’-UTR來抑制P4HA2的表達，而低氧條件下通過下調(diào)miR-495的表達來促進P4HA2的表達，進而促進肝細胞癌中ECM膠原的沉積，參與肝纖維化和肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 組織與細胞 臨床肝細胞癌組織及其相應(yīng)的非腫瘤肝組織(28例份)。取得患者知情同意書，同意將其手術(shù)組織用于本研究。研究方案經(jīng)醫(yī)院研究倫理委員會批準(zhǔn)。人肝癌細胞系HepG2維持在DMEM培養(yǎng)基中(Gibco，CA，USA)，同時補充10%的熱滅活的胎牛血清(Gibco，CA，USA)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml的鏈霉素，置于含5%CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱中。正常氧條件為20% O2，低氧條件為1%O2。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建 將人P4HA2基因的全長cDNA克隆到pcDNA3.1質(zhì)粒中以產(chǎn)生pcDNA3-P4HA2。將P4HA2 mRNA的3’-UTR中含有miR-495的靶位點的片段亞克隆到pGL3-對照載體中以產(chǎn)生pGL3-P4HA2-wt，突變靶位點以產(chǎn)生pGL3-P4HA2-mut。構(gòu)建引物如下：pcDNA3-P4HA2(正向)，5’-CTAGCTAGCATGATCTGGTA-TATATTAATT-3’，(反向)5’-CCGCTCGAGTCATTCCAATTCTG ACAACGT-3’;pGL3-P4HA2-wt(正向)5’-GCTCTCGA-CAGGAGTTTACAATTGAC-3’，(反向)5’-GGGGGCCGGCCAAGG-CATTTGTTTCCTATCA-3’;pGL3-P4HA2-mut(正向)5’-GCTCTCGACAGGATCC-TGTAATTGAC-3’，(反向)5’-GGGGGCCGGCCAAGGCATTTGTTTCCTATCA-3’。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染 將細胞在6孔或24孔板中培養(yǎng)24 h，然后用Lipofectamine 2000試劑進行所有質(zhì)粒miRNA或siRNA轉(zhuǎn)染。P4HA2 siRNA寡核苷酸和非特異性對照(si-對照)，miR-495(或抗miR-495)，miRNA對照和抗miRNA的對照都由廣州銳伯公司合成。P4HA2的siRNA序列如下：si-P4HA2-1，5’-ATTTGAGCT-ATGCGGTATATCdTdT-3’; si-P4HA2-2, 5’-CCTGTGGTGTCTCGAA-TTAATdTdT-3’。

1.4 熒光素酶報告基因測定 將細胞接種到24孔板中(每孔3×104個細胞)。24 h后，用含有Renilla螢光素酶基因的pRL-TK質(zhì)粒(每孔50 ng)和含有P4HA2 3’-UTR的種子序列或突變種子序列的各種構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染細胞(每孔100 ng)。在轉(zhuǎn)染后48 h，進行標(biāo)準(zhǔn)的雙熒光素酶報告基因測定，并使用pRL-TK對結(jié)果進行標(biāo)準(zhǔn)化。所有實驗至少進行3次。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和定量實時聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 使用Trizol從細胞(或組織)中提取總RNA。對于成熟的miR-495的檢測，通過poly(A)聚合酶對總RNA進行多聚腺苷酸化，使用ImPro-Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega，Madison，WI，USA)對含poly(A)尾的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。按Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)所述方法進行qRT-PCR。使用的引物如下：P4HA2(正向)5’-GGCAGCCAAAGCTCTGTTAC-3’(反向)，5’-AAAGCAGTCCT-CAGCCGTTA-3’;GAPDH正向，5’-ATCACCATCTTC CAGGAGCGA-3’，(反向)5’-CCTTCTCCAT GGTGGTGAAGAC-3’;miR-495(正向)5’-TGTAAACATCCTTGACTGGAAG-3’，(反向)5’-GCGAGCACAGAATTAATACG-AC-3’;U6(正向)5’-CTCGCTTCGGCAGCA CA-3’，(反向)5’-AACGCTTCACGAA-TTTGCGT-3’。

1.6 蛋白質(zhì)印跡分析 使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白。通過凝膠電泳分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉后，將膜與用于小鼠抗β-actin，兔抗-P4HA2的一抗孵育。然后，在室溫下用PBS-T稀釋的二抗孵育1 h。在PBS-T中洗滌膜，并通過增強的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)Western Blotting Detection Reagents檢測結(jié)合的抗體。所有實驗重復(fù)3次。

1.7 細胞增殖實驗 將HepG2細胞接種在24孔板中，轉(zhuǎn)染48 h后，使用能摻入檢測細胞的EdU細胞增殖測定試劑盒。將細胞與50 μmol/L EdU一起孵育2 h，4%多聚甲醛固定細胞，0.5%Triton透化后進行EdU染色。在熒光顯微鏡下計數(shù)EdU陽性細胞的比例。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 收集的數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。組間比較采用t檢驗，3組及以上之間比較采用單因素方差分析。miR-495與P4HA2的相關(guān)性分析使用皮爾遜相關(guān)性檢測。每個實驗重復(fù)至少3次，雙側(cè)P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 miR-495抑制P4HA2的表達情況 使用Targetscan，Miranda和Pictar篩選miR-495的靶基因，發(fā)現(xiàn)P4HA2是miR-495的靶基因之一。見圖1。

圖1 miR-495抑制P4HA2的表達圖

A:miR-495在P4HA2 mRNA 的3’ UTR中的結(jié)合位點，B:克隆了P4HA2的mRNA(或它的突變體)的3’-UTR到pGL3熒光素酶報告基因載體(命名為pGL3-P4HA2-wt或pGL3-P4HA2-muT);C:螢光素酶報告基因檢測顯示miR-495顯著抑制了HepG2細胞中pGL3-P4HA2-wt的熒光素酶活性，并且是劑量依賴性地抑制，但不能抑制pGL3-P4HA2-mut的熒光素酶活性；D：通過抗miR-495抑制內(nèi)源性的miR-495表達可以增加pGL3-P4HA2-wt的熒光素酶活性，但不能改變P4HA2-mut的熒光素酶活性。

2.2 miR-495抑制HepG2細胞中的P4HA2表達情況 我們在HepG2細胞中進行了miR-495的瞬時轉(zhuǎn)染。見圖2。

圖2 miR-495抑制HepG2細胞中的P4HA2表達圖

A：miR-495的過表達能夠在HepG2細胞中以劑量依賴性方式抑制P4HA2的mRNA和蛋白水平的表達；B：當(dāng)內(nèi)源性miR-495被抗miR-495下調(diào)時，HepG2細胞中P4HA2的表達增加。

2.3 低氧條件下下調(diào)miR-495表達水平促進HepG2細胞增殖的情況 EdU檢測表明，用miR-495處理時HepG2細胞增殖減少，但過表達P4HA2可以挽救miR-495介導(dǎo)的增殖減少。見圖3。

圖3 低氧條件下miR-495促進HepG2細胞增殖圖

A：P4HA2 siRNA的共轉(zhuǎn)染能夠抑制抗miR-495誘導(dǎo)的細胞增殖加速。結(jié)果表明miR-495通過P4HA2抑制肝癌細胞的增殖。B:HepG2細胞置于低氧環(huán)境中培養(yǎng)，qPCR檢測結(jié)果表明低氧條件下HepG2細胞中miR-495的表達顯著低于正常組，而P4HA2的表達顯著高于正常組。低氧組HepG2細胞中EdU陽性細胞數(shù)顯著增加。C：低氧組中過表達miR-495可以明顯逆轉(zhuǎn)HepG2細胞的增殖，與正常組沒有顯著差異。

2.4 miR-495與臨床肝細胞癌組織中的P4HA2相關(guān)性 我們使用qRT-PCR分析驗證了28個臨床配對的肝細胞癌和相鄰的腫瘤周圍組織中miR-495和P4HA2 mRNA之間的關(guān)系，結(jié)果表明miR-495的水平與P4HA2的mRNA的水平呈負相關(guān)(r=-0.683，P<0.05)。見圖4。

圖4 miR-495與臨床肝細胞癌組織中的P4HA2相關(guān)性圖

A：P4HA2 mRNA的表達在肝細胞癌樣本中顯著高于癌旁正常組織；B：miR-495水平與P4HA2的mRNA水平的相關(guān)性

3 討論

肝細胞癌的發(fā)生和發(fā)展涉及多個通路和多個基因的分子改變的活化。已經(jīng)證明miRNA在多種生物過程中起重要作用，通過不同的機制來調(diào)節(jié)肝細胞癌的發(fā)生。且有報道發(fā)現(xiàn)多種miRNA通過直接調(diào)節(jié)靶基因的mRNA表達水平來調(diào)節(jié)肝細胞癌的發(fā)展，其中miR-495在肝細胞癌中下調(diào)[8,9]。然而，miR-495在肝細胞癌中的具體作用機制知之甚少。我們研究了miR-495在肝癌發(fā)生中的作用機制。

首先，我們通過生物信息學(xué)分析預(yù)測了miR-495的靶基因。P4HA2是miR-495的靶基因之一，涉及癌癥發(fā)展過程中的膠原蛋白合成。我們的結(jié)果表明在肝細胞癌HepG2細胞miR-495能夠直接靶向到P4HA2 mRNA的3’-UTR。此外，qRT-PCR和Western Blot分析表明，HepG2細胞中miR-495可以下調(diào)P4HA2的表達水平，這一結(jié)果也支持P4HA2是miR-495的靶基因之一。P4HA2是動物細胞內(nèi)膠原蛋白合成所需的關(guān)鍵酶。ECM為細胞提供物理框架，并啟動關(guān)鍵細胞事件，如粘附、遷移、增殖、分化和存活[10]。 膠原蛋白是人體中最豐富的蛋白質(zhì)，為ECM提供支架。膠原蛋白包含大量結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)，每個蛋白質(zhì)含有通過重復(fù)GXY序列形成獨特的三螺旋結(jié)構(gòu)(其中G是甘氨酸，X通常是脯氨酸或賴氨酸，Y通常是羥脯氨酸)。P4HA2受到許多分子的調(diào)節(jié)。例如，缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1能增加缺氧條件下纖維細胞中P4HA2的表達，導(dǎo)致膠原蛋白沉積增加。IL-6通過RAF-MEK1/2 - ERK1/2 - MAPK和c-Jun通路下調(diào)P4HA2的表達，導(dǎo)致小鼠動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定[11]。

缺氧作為一種細胞刺激，能促進組織纖維化。在癌癥中，腫瘤內(nèi)缺氧與侵襲、轉(zhuǎn)移、治療失敗和患者死亡風(fēng)險增加有關(guān)。缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)和HIF-2是細胞適應(yīng)低氧條件的關(guān)鍵介質(zhì)。HIF-1是異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，由組成型表達的HIF-1β亞基和O2調(diào)節(jié)的HIF-1α亞基組成。在低氧條件下，HIF-1α蛋白是穩(wěn)定的，與HIF-1β二聚化，并激活多個下游靶基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。我們將HepG2細胞置于低氧環(huán)境中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)低氧能誘導(dǎo)miR-495的表達下調(diào)、P4HA2的表達上調(diào)，并且促進HepG2細胞的增殖，因此我們認(rèn)為低氧環(huán)境可能通過調(diào)節(jié)miR-495和其靶基因P4HA2的表達，進而參與了肝組織中膠原蛋白的沉積，最終影響了肝纖維化和肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展。此外，miR-495參與多種其他腫瘤的發(fā)生和進展，如食道癌、膠質(zhì)瘤、非小細胞肺癌和乳腺癌[13]。這些結(jié)果表明miR-495在癌癥發(fā)生中起重要作用。P4HA2介導(dǎo)的膠原蛋白和ECM的沉積伴隨腫瘤進展[14]。臨床肝細胞癌樣品中，miR-495的表達水平與P4HA2的表達水平呈負相關(guān)。這些結(jié)果都支持我們分析的機制，并為miR-495在肝癌發(fā)生中的作用提供了新的佐證。miR-495或P4HA2可以作為肝癌中有希望的治療靶標(biāo)。