陳沁磊 邵 銘△ 何 晶 胡謙鋒

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院江蘇省中醫(yī)院感染科 (江蘇 南京， 210001) 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)

肝纖維化指的是由于各種致病因素導(dǎo)致肝臟結(jié)締組織增生異常，以致肝臟內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過(guò)度沉淀的病理過(guò)程?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為肝星狀細(xì)胞的活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。若未得到及時(shí)干預(yù)則會(huì)進(jìn)入到肝硬化的階段。本文對(duì)養(yǎng)肝澳平合劑抗肝纖維化的效果以及作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。使用四氯化碳/橄欖油誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，監(jiān)測(cè)大鼠血清生化指標(biāo)、肝組織含量及肝臟病理改變，對(duì)養(yǎng)肝澳平合劑治療肝纖維化的作用進(jìn)行綜合評(píng)估，探討肝纖維化與細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1、基質(zhì)金屬蛋白酶(TIMP)-1之間的表達(dá)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 動(dòng)物：SD大鼠84只，雌雄各半，清潔級(jí)，體質(zhì)量(180±20)g。由江蘇省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-(蘇)2012-0004，揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

藥物：養(yǎng)肝澳平合劑：由茵陳、當(dāng)歸、丹皮、茜草、鳳尾草、蛇舌草、赤芍、郁金、砂仁、紫草、大腹皮、丹參、土茯苓等組成，江蘇省中醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)：Z04000376。扶正化瘀膠囊：由丹參、發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉、桃仁、松花粉、絞股藍(lán)、五味子組成，上海黃海制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：Z20020074。秋水仙堿片：云南昊邦制藥有限公司，批號(hào)：H53021798。

試劑：四氯化碳分析純：南京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：13052910772 。使用時(shí)用橄欖油配合成40%的油溶液。甲醛溶液：南京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：12042410659；(TGF)-β1、TIMP-1抗體，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20100328。即用型快速免疫組化MaxVisionTM試劑盒：福州邁新生物公司提供，批號(hào)：KIT-5030總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)試盒、丙二醛(MDA)測(cè)試盒、羥脯氨酸(HyP)測(cè)試盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所?？捡R斯亮蘭蛋白定量測(cè)試盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

儀器：TDL-80-2B低速離心儀：上海安亭科學(xué)儀器廠；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；MODEL DS-671電子秤：上海寺岡電子有限公司；756PC紫外線分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司； RM2135型石蠟切片機(jī)：德國(guó)LEICA公司產(chǎn)品； Tissue-Tek TEL 組織包埋中心：日本SAKURA公司產(chǎn)品；DM-2000光學(xué)顯微鏡：德國(guó)LEICA公司產(chǎn)品。

1.2 造模分組及給藥方法 84只清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為7組，即正常組10只，模型組14只，養(yǎng)肝澳平高、中、低劑量組各12只，扶正化瘀及秋水仙堿組各12只。SD大鼠肝纖維化造模采用40%的四氯化碳/橄欖油腹腔注射，劑量為1 ml/kg，每周2次，共4周。造模1周后給藥。正常組與模型組用蒸餾水按20 ml/kg的量進(jìn)行灌胃；其中養(yǎng)肝澳平高、中、低劑量組給藥濃度分別為28、14、7 g/kg，扶正化瘀組給藥濃度劑量為0.9 g/kg，秋水仙堿組劑量為1.0 mg/kg，每天按20 ml/kg的藥量灌胃給藥1次，共給藥8周。所有大鼠每周稱重1次，根據(jù)體質(zhì)量變化情況調(diào)整給藥劑量。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 病理學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 采用HE染色和Masson染色法。參照1995年慢性肝炎肝纖維化分級(jí)分期標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 血清生化指標(biāo) 血清分離后直接用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、谷氨酰轉(zhuǎn)化酶(GGT)、總膽紅素(TBil)、直接膽紅素(DBil)含量，由江蘇省中醫(yī)院檢驗(yàn)科協(xié)助完成。

1.3.3 肝組織T-SOD、MDA、HyP含量測(cè)定 先采用考馬斯亮藍(lán)法計(jì)算出待測(cè)樣本蛋白濃度，再按公式計(jì)算出肝組織T-SOD、MDA含量。

1.3.4 TGF-β1、TIMP-1含量的檢測(cè) 采用快速免疫組化方法。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件分析。計(jì)量資料用表示，組間差異用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)前均對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠生存情況 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，共死亡12只大鼠，其中正常組1只，模型組6只，高劑量組1只，低劑量組1只，扶正化瘀組1只，秋水仙堿組2只。

2.2 各組肝臟病理變化情況 HE染色發(fā)現(xiàn)模型組可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)破壞并重新排列，小葉內(nèi)及小葉間有明顯的炎癥、壞死，肝細(xì)胞變性壞死，肝索排列不規(guī)則，伴有明顯的纖維組織增生。各治療組肝損傷均有不同程度的減輕，養(yǎng)肝澳平高劑量組僅有輕度炎性浸潤(rùn)及脂肪變性，肝細(xì)胞水腫不明顯，無(wú)明顯的纖維組織增生。秋水仙堿組及扶正化瘀組亦有肝纖維組織增生減少、纖維間隔變窄及炎癥減輕等，但肝纖維化程度以養(yǎng)肝澳平組最優(yōu)。見(jiàn)彩插頁(yè)圖1。Masson染色顯示模型組表現(xiàn)為小葉結(jié)構(gòu)破壞，膠原纖維彌漫性增生，并形成條索狀像周圍布散，形成纖維間隔。治療組均有不同程度的肝纖維化，但較模型組有明顯減輕。養(yǎng)肝澳平高劑量組最優(yōu)，僅有少量呈淡藍(lán)色的膠原纖維，無(wú)明顯肝小葉破壞及纖維間隔；秋水仙堿組次之，匯管區(qū)周圍可見(jiàn)有少量纖維組織沉積，其余組肝纖維化無(wú)明顯差異。見(jiàn)彩插頁(yè)圖2。各組大鼠肝纖維化分級(jí)評(píng)分見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肝纖維化分級(jí)評(píng)分 (只)

2.2 各組大鼠血清生化指標(biāo)的比較 見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較

與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3 各組大鼠肝組織T-SOD、MDA、HyP含量的比較 見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠肝組織T-SOD、MDA、HyP含量

與正常組比較，△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.4 各組大鼠肝組織TGF-β1、TIMP-1表達(dá) 模型組TGF-β1表達(dá)明顯增加，匯管區(qū)、纖維間隔可見(jiàn)大量加深的陽(yáng)性染色。其余各組可見(jiàn)TGF-β1不同程度減少，養(yǎng)肝澳平高劑量組尤顯，僅在匯管區(qū)可見(jiàn)少量陽(yáng)性染色。TIMP-1在模型組陽(yáng)性表達(dá)范圍較廣，尤其是纖維間隔、匯管區(qū)、竇周細(xì)胞，棕黃色著色。養(yǎng)肝澳平高、中劑量組及秋水仙堿組TIMP-1沉積明顯減輕，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著減少。各組大鼠肝組織TGF-β、TIMP-1的平均光密度值，見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠肝組織TGF-β1、TIMP-1平均光密度值比較

與正常組比較，△P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

肝纖維化是慢性肝病發(fā)展成為肝硬化的共同病理基礎(chǔ)，其中肝星狀細(xì)胞的活化是中心環(huán)節(jié)。因此對(duì)肝纖維化的治療及機(jī)制探討極為重要。

SOD、MDA為脂質(zhì)過(guò)氧化物指標(biāo)，SOD主要反映氧自由基的清除能力，有“高效的清道夫”之稱[1]。MDA則能反映肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的強(qiáng)弱,能反映肝臟損傷的程度[2]。二者配合測(cè)定從而更準(zhǔn)確地反映肝纖維化的程度。HyP是膠原纖維組織中特有的非必須氨基酸，間接反映肝臟膠原蛋白的含量，直接反映肝纖維化的程度。TGF-β1是目前被認(rèn)為最強(qiáng)的肝纖維化致病因子，不僅能通過(guò)“旁分泌”的形式多途徑促進(jìn)肝星狀細(xì)胞(HSC)的活化,加速膠原纖維的合成及ECM的沉積；還能阻止MMPs的合成、促進(jìn)TIMPs生成，從而抑制ECM的降解[3]。TIMPs是抑制MMPS活性的一組糖蛋白，在肝臟組織中僅發(fā)現(xiàn)TIMP-l和TIMP-2，其中TIMP-1的抑制作用最強(qiáng)。HSC激活增殖后，TIMP-1不斷升高，特異性與MMP-1相結(jié)合，從而抑制MMP-1活性，減少Ⅰ、Ⅲ型膠原等ECM的降解，加速ECM的沉積及肝纖維化進(jìn)程[4]。

目前中醫(yī)藥治療肝纖維化主要采取扶正化瘀法，而針對(duì)清熱解毒化濕法研究較少。養(yǎng)肝澳平合劑是江蘇省中醫(yī)院內(nèi)制劑，是俞榮青主任的經(jīng)驗(yàn)方，該方由茵陳、當(dāng)歸、丹皮、茜草、鳳尾草、蛇舌草、赤芍、郁金、砂仁、紫草、大腹皮、丹參、土茯苓等組成，具有活血涼血、清熱利濕解毒的功效，本方最初是在治療慢性乙型肝炎的研究成果的基礎(chǔ)上提出的，但對(duì)于濕熱疫毒內(nèi)存、血瘀于肝的肝纖維化尤為適宜。俞榮青等[5]通過(guò)用養(yǎng)肝澳平合劑治療，觀察慢乙肝患者的短期、長(zhǎng)期療效及血清乙肝病毒標(biāo)志物變化，結(jié)果表明經(jīng)養(yǎng)肝澳平治療，血清HBV標(biāo)志物轉(zhuǎn)陰率增高，感染鴨血中DHBV-DNA可被抑制，肝細(xì)胞損傷減輕，肝纖維化減少。車軍勇等[6]用養(yǎng)肝澳平合劑治療肝纖維化患者，與對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)治療組患者肝功能及肝纖維化指標(biāo)明顯好轉(zhuǎn)。姚志剛等[7]納入濕熱血瘀證型的乙型肝炎肝纖維化患者40例，服用養(yǎng)肝澳平治療，并與扶正化瘀膠囊做陽(yáng)性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)肝澳平合劑能明顯改善患者肝功能與肝纖維化水平，升高A/G比值，并能顯著改治療患者的癥狀和體征。

通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)研究，我們可以推測(cè)，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中，養(yǎng)肝澳平合劑能通過(guò)減少TGF-β1的分泌，抑制HSC的活化增殖；抑制TIMP-1的表達(dá)，增加MMP-1的活性，促進(jìn)Ⅰ、Ⅲ型膠原等ECM的降解，從而改善肝纖維化的進(jìn)程。