熊峰 李云云 國海東 李郅穎 林盛聰 羅安東

摘要?通過乙醇-水楊酸的體外抗氧化模型、等輻射分析方法及石榴籽油的加速氧化試驗(yàn)，研究了迷迭香提取物、L-抗壞血酸棕櫚酸酯、茶多酚和茶多酚棕櫚酸酯等抗氧化劑之間的協(xié)同作用。結(jié)果表明，抗氧化劑之間的協(xié)同性受其組成和比例的影響，迷迭香提物體與L-抗壞血酸棕櫚酸酯、茶多酚棕櫚酸酯在不同比例下分別表現(xiàn)出協(xié)同性和拮抗性，迷迭香提取物與茶多酚在不同的比例下均表現(xiàn)出協(xié)同性，且兩者間的比例為1∶9時(shí)，協(xié)同性最高（37.62%），此時(shí)在石榴籽中的抗氧化效果與TBHQ相當(dāng)。

關(guān)鍵詞?抗氧化劑;等輻射分析法;協(xié)同作用;石榴籽油

中圖分類號(hào)?TQ?911文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2019）23-0190-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.055

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Antioxidant Activity of Compound Antioxidants in Pomegranate Seed Oil

XIONG Feng， LI Yun?yun， GUO Hai?dong et al

（Guangzhou Honsea Sunshine Biotech Co.， Ltd.，Guangzhou， Guangdong 510530）

Abstract?Synergistic effects between antioxidants such as rosemary extract， L?ascorbyl palmitate， tea polyphenols and tea polyphenol palmitate were investigated by the in vitro antioxidant model of ethanol?salicylic acid， the isobolographic analysis and the accelerated oxidation test of pomegranate seed oil. The results showed that the composition and ratio of compound antioxidants showed different synergy. The L?ascorbic acid palmitate and tea polyphenol palmitate with rosemary extract showed synergy and antagonistism at different ratios， respectively. The rosemary extract with tea polyphenols showed synergy at different ratios， and when the ratio between the two was 1∶9， the synergy was the highest （37.62%）， and the antioxidant effect in pomegranate seeds could be equivalent to TBHQ.

Key words?Antioxidant;Isobolographic analysis method;Synergistic effect;Pomegranate seed oil

石榴（Punica granatum L.）是石榴科石榴屬植物，分布在我國亞熱帶及溫帶地區(qū)，其籽含油率高達(dá)20%以上。石榴籽油是一種植物源的多不飽和共軛脂肪酸，主要成分為石榴酸，含量高達(dá)60%～85%[1]，具有較好的抗氧化性、抗癌、增強(qiáng)免疫力、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用，被廣泛用于保健食品與醫(yī)藥領(lǐng)域[2-5]。但石榴酸由于獨(dú)特的共軛三烯結(jié)構(gòu)，易在光、空氣、熱及水分等因素作用下發(fā)生酸敗，使石榴籽油的口感、風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值受到極大影響。為了減緩或預(yù)防石榴籽油的氧化變質(zhì)，加入抗氧化劑是提高石榴籽油貯藏穩(wěn)定性的一種有效方式。

合成抗氧化劑如BHT（二丁基羥基甲苯）、BHA（叔丁基羥基茴香醚）和TBHQ（叔丁基對(duì)苯二酚）等由于具有產(chǎn)量大、價(jià)格低、抗氧化較強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，長期以來一直是食品抗氧化劑市場的主流產(chǎn)品。但近年來研究表明，BHT、BHA與TBHQ具有一定的毒性和致癌作用[6]，歐盟和日本等已經(jīng)禁止或限制這類型抗氧化劑在食品加工中使用[7]。尋找更加安全、健康、綠色的抗氧化劑已成為食品加工領(lǐng)域的趨勢。

該研究參考GB 2760—2007《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》，利用4種抗氧化劑復(fù)配一款在石榴籽油中抗氧化性能與TBHQ相當(dāng)?shù)膹?fù)配抗氧化劑，并為其他油脂深加工提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料與儀器

石榴籽油，廣州合誠三先生物科技有限公司自制，初始過氧化值為0.75 mmol/kg?？寡趸瘎好缘闾崛∥铮ㄊ笪膊菟帷?0%，廣州合誠三先生物科技有限公司）、茶多酚（TP≥95%，浙江天草生物科技有限公司）、L-抗壞血酸棕櫚酸酯（東莞市感恩食品科技有限公司）、茶多酚棕櫚酸酯（成都華高生物制品有限公司）、THBQ（廣東大地食用化工有限公司），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

UV Blue star B型紫外可見分光光度計(jì)（北京萊伯泰科技儀器有限公司）;DHG-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;HHS-21-4型恒溫水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;PRECISA125A型電子天平（瑞士普利賽斯）。

1.2?方法

油脂的氧化過程主要為酶促氧化、光氧化和自動(dòng)氧化，其最主要過程為自動(dòng)氧化[8]。光氧化是通過自由基引發(fā)油脂氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而加速油脂的氧化，通過抑制油脂中自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)能顯著延長油脂的保質(zhì)期。通過建立乙醇-水楊酸的體外抗氧化模型評(píng)價(jià)復(fù)配抗氧化劑的自由基清除能力，從而間接評(píng)價(jià)復(fù)配抗氧劑在油脂中的抗氧化活性。

1.2.1?自由基清除率測定。

取1 mL的FeSO4溶液（10 mmol/L）于試管中，加入1 mL的水楊酸-乙醇溶液（10 mmol/L），搖勻后加入1 mL復(fù)配抗氧化劑已知濃度的樣品液，最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃，水浴1 h，冷卻至室溫，在波長510 nm處測吸光度。在其他條件不變下，以TBHQ替換復(fù)配抗氧化劑作為陽性對(duì)照[9]。則羥基自由基（·OH）清除率計(jì)算公式如下：

K=[1-（A1-A2）/A3] ×100%（1）

式中，A1為無水乙醇代替復(fù)配抗氧化劑作為空白;A2為樣品液;A3為無水乙醇代替H2O2的樣品本底溶液。

1.2.2?等輻射分析法。

等輻射分析法（isobolographic analysis）是一種簡單、精準(zhǔn)分析藥物之間相互作用的方法，現(xiàn)廣泛用于藥物協(xié)同作用的定性與定量方面研究[10-11]。采用等輻射分析法研究迷迭香提取物分別與茶多酚、茶多酚棕櫚酸酯、L-抗壞血酸棕櫚酸酯等抗氧化劑復(fù)配后的協(xié)同作用。以迷迭香提取物、茶多酚、茶多酚棕櫚酸酯和L-抗壞血酸棕櫚酸酯單獨(dú)對(duì)自由基清除率的IC50作為參考值，按照表1所示比例進(jìn)行復(fù)配試驗(yàn)，計(jì)算復(fù)配組的清除率及IC50。

1.2.3?統(tǒng)計(jì)分析。

對(duì)復(fù)配抗氧化劑之間協(xié)同作用進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用GraphPad Prism回歸分析繪制濃度-效應(yīng)曲線，求得IC50，并根據(jù)Luszczki等[12]方法，由相加等效公式（2）分別計(jì)算復(fù)配抗氧化劑的理論值IC50add。

IC50add=IC50AP1+R×P2（2）

式中，R為A、B這2種抗氧化劑單獨(dú)使用時(shí)的效價(jià)比，即R=IC50A/IC50B;P1為抗氧化劑A在復(fù)配組所占比例;P2為抗氧化劑B在復(fù)配組所占的比例，P1=1-P2;由試驗(yàn)得到復(fù)配組實(shí)際IC50mix值，若IC50mix值小于IC50add值，表示相互作用為協(xié)同作用，且協(xié)同率計(jì)算公式如下：

Y=IC50add-IC50mixIC50add×100%（3）

1.2.4?石榴籽油加速試驗(yàn)。

分別取50 g石榴籽油置于透明、統(tǒng)一規(guī)格的試劑瓶中，按照石榴籽油質(zhì)量的 0.02%添加復(fù)配抗氧化劑，與石榴籽油混合均勻后，置于溫度（60±1）℃的鼓風(fēng)干燥箱中，進(jìn)行21 d加速試驗(yàn)，并計(jì)算POV值，TBHQ作為陽性對(duì)照。POV值的測定參考GB 5009.227—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品》中過氧化值的測定。

1.2.5?數(shù)據(jù)處理。

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖，·OH清除率的IC50值采用SPSS22.0進(jìn)行計(jì)算，試驗(yàn)組值與空白組值采用one-way ANOVA分析，以P<0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

2?結(jié)果與分析

2.1?幾種抗氧化劑清除能力比較

迷迭香提取物、L-抗壞血酸棕櫚酸酯、茶多酚、茶多酚棕櫚酸酯及TBHQ對(duì)·OH清除能力如圖1所示。在濃度為0.2～2.0 mg/mL下，5種抗氧化劑對(duì)·OH的清除率與濃度劑量呈正相關(guān)，當(dāng)濃度達(dá)2.0 mg/mL時(shí)，迷迭香提取物、L-抗壞血酸棕櫚酸酯、茶多酚、茶多酚棕櫚酸酯及TBHQ對(duì)·OH清除率為61.69%、99.3%、78.30% 、64.27%和96.78%，其IC50值分別為1.52、0.96、0.82、1.57和0.48 mg/mL，IC50值越低，其消除效果越好。

2.2?等輻射分析法分析復(fù)配抗氧化劑之間的協(xié)同作用

采用GraphPad Prism6.0軟件將按照表2所測復(fù)配抗氧化劑的IC50值繪制在等輻射圖上，再將兩抗氧化劑單獨(dú)作用的IC50值和95%的置信區(qū)間分別繪制于坐標(biāo)軸上。復(fù)配點(diǎn)的IC50值落在相加效應(yīng)線上或置信限內(nèi)，則表示兩抗氧劑間的作用為相加;若落在相加效應(yīng)線的置信限左側(cè)，則為協(xié)同作用;若落在右側(cè)，則為拮抗作用[13]。

由圖2和表2可知，在乙醇-水楊酸模型中，迷迭香提取物與茶多酚在不同的復(fù)配比例下均表現(xiàn)出協(xié)同作用，復(fù)配比例為1∶9時(shí)，表現(xiàn)出最高的協(xié)同作用（協(xié)同率37.62%）;迷迭香提取物與茶多酚棕櫚酸酯、L-抗壞血酸棕櫚酸酯的部分比例表現(xiàn)出協(xié)同作用，復(fù)配比例為1∶9時(shí)，迷迭香提取物與茶多酚棕櫚酸酯表現(xiàn)出最高的協(xié)同作用（協(xié)同率20.79%），復(fù)配比例為9∶1時(shí)，迷迭香提取物與L-抗壞血酸棕櫚酸酯表現(xiàn)出最高的協(xié)同作用（協(xié)同率20.79%），同時(shí)，也有部分復(fù)配比例表現(xiàn)出拮抗作用，如迷迭香提取物與茶多酚棕櫚酸酯比例為3∶7（協(xié)同率-79.64%）、迷迭香提取物與L-抗壞血酸棕櫚酸酯比例為7∶3（協(xié)同率-60.30%）。

2.3?石榴籽油的加速試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)上述等輻射分析結(jié)果，分別選取不同復(fù)配組合的最佳比例（迷迭香提取物與茶多酚比例為1∶9、迷迭香提取物與茶多酚棕櫚酸酯比例為9∶1、迷迭香提取物與L-抗壞血酸棕櫚酸酯為9∶1），采用Schaal法進(jìn)行21 d的石榴籽油加速氧化試驗(yàn)，TBHQ為陽性對(duì)照，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

在等量添加的情況下，隨著加速時(shí)間的延長，各試驗(yàn)組的POV值均呈現(xiàn)上升的趨勢?？瞻讓?duì)照組的POV值上升最快，陽性對(duì)照組（TBHQ）上升最慢，迷迭香提取物+茶多酚復(fù)配組的上升趨勢與陽性對(duì)照基本吻合，迷迭香提取物+茶多酚和迷迭香提取物+L-抗壞血酸棕櫚酸酯復(fù)配組的上升趨勢介于空白與陽性對(duì)照之間。對(duì)各試驗(yàn)組與空白組的POV值進(jìn)行t檢驗(yàn)，P值均小于0.01，與空白對(duì)照組存在顯著性差異，說明添加抗氧化劑能顯著抑制石榴籽油的氧化作用。在21 d時(shí)，迷迭香提取物+茶多酚復(fù)配組的POV值為9.74 mmol/kg（2.4 g/kg），接近TBHQ的POV值9.03 mmol/kg（2.3 g/kg），未超過GB 2716—2018食用油要求POV的限值2.5 g/kg，表明該復(fù)配組在石榴籽油中的抗氧化性能與TBHQ相當(dāng)，且延長石榴籽油的貨架期。

3?結(jié)論

該研究通過建立乙醇-水楊酸自由基清除模型，采用等輻射分析法對(duì)迷迭香提取物、L-抗壞血酸棕櫚酸酯、茶多酚和茶多酚棕櫚酸酯等復(fù)配組分及比例之間的協(xié)同抗氧化能力進(jìn)行研究，結(jié)果顯示4種抗氧化劑間的復(fù)配組分及比例對(duì)其抗氧化能力均具有顯著性影響，其中協(xié)同效應(yīng)最強(qiáng)組合是迷迭香提取物與茶多酚比例為1∶9，且該組合石榴籽油中的抗氧化性能與TBHQ相當(dāng)。

不同的油脂所含不飽和脂肪酸程度不同，且同一抗氧化劑對(duì)不同飽和度的油脂抗氧化效果也存在差異。該研究復(fù)配組僅在石榴籽油中開展驗(yàn)證，該復(fù)配組能否替代THBQ在其他油脂中應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究。

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