李艷　徐欣然　呂曉峰　侯莉莉　陳夢(mèng)靜

摘要? [目的]建立一種測(cè)定雞蛋中硝基呋喃類代謝物殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。[方法]樣品經(jīng)在酸性條件下水解，加入衍生試劑2-硝基苯甲醛，37? ℃避光孵育16 h，Na2EDTA-McⅡ-vaine緩沖溶液和乙酸乙酯共同提取，經(jīng)固相萃取去除基質(zhì)中的干擾物，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。[結(jié)果]4種獸藥殘留采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，在0.1～20.0 μg/kg線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，方法回收率為79.85%～102.17%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.64%～9.16%，定量限為0.5 μg/kg。[結(jié)論]該方法前處理相對(duì)簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確且靈敏度高，適用于雞蛋中4種硝基呋喃類代謝物藥物殘留檢測(cè)。

關(guān)鍵詞? 雞蛋;硝基呋喃類代謝物;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;殘留

中圖分類號(hào)? S859.84??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

文章編號(hào)? 0517-6611（2019）24-0199-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.060

Determination of Four Metabolite Residues of Nitrofuran Antibiotics in Eggs by Liquid Chromatography-tande mmol/Lass Spectrometry

LI Yan1，XU Xin-ran2，Lu Xiao-feng1 et al? （1.Supervision and Testing Center for Agricultural Product Quality of Yancheng City，Yancheng，Jiangsu 224002;2.College of Veterinary，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009）

Abstract? [Objective]The research aimed to establish a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of nitrofuran metabolite residues in eggs.[Method]The sample was hydrolyzed under acidic conditions，and the derivatizing reagent 2-nitrobenzaldehyde was added.The mixture was incubated at 37? ℃ for 16 h in the dark.The Na2EDTA-McII-vaine buffer solution and ethyl acetate were co-extracted，the interfering substances in the matrix were removed by solid phase extraction and detected by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.[Result]The residues of the four veterinary drugs were quantified by isotope internal standard method.The linear relationship was good at 0.1-20.0 μg/kg，the correlation coefficient was greater than 0.99，the recovery rate was 79.85%-102.17%，and the relative standard deviation （RSD） was 1.64%-9.16%.The limit of quantification is 0.5 μg/kg.[Conclusion]The method is relatively simple，accurate and sensitive，and is suitable for the detection of four nitrofuran metabolites in eggs.

Key words? Eggs;Nitrofuran metabolites;Liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）;Residue

作者簡(jiǎn)介

李艷（1984—），女，江蘇濱海人，畜牧師，碩士，從事農(nóng)畜產(chǎn)品藥物殘留檢測(cè)及方法研究。

收稿日期? 2019-06-05

硝基呋喃類藥物主要包含呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林，因硝基呋喃類原型藥在生物體內(nèi)代謝迅速，故常用檢測(cè)代謝物藥物來反映硝基呋喃類藥物的殘留狀況，其代謝產(chǎn)物分別為AOZ（3-氨基-2-惡唑烷酮）、AMOZ（5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮）、AHD（1-氨基-2-乙內(nèi)酰）、SEM（氨基脲）。它是一類廣譜的抗菌藥物，對(duì)常見的革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌有抑制作用，常用于預(yù)防或治療禽、豬、牛胃腸道疾病，有時(shí)也會(huì)作為飼料添加劑使用[1-2]。但是動(dòng)物大劑量或長(zhǎng)期使用硝基呋喃類藥物會(huì)引起中毒性反應(yīng)，且由于硝基呋喃類抗生素的代謝物在動(dòng)物組織中代謝降解慢，并容易在體內(nèi)蓄積，一旦被人類長(zhǎng)期食用，甚至可能會(huì)引起致癌、致畸、致突變[3-5]。FDA已于2002年禁止了硝基呋喃類在動(dòng)物性食品中的使用;農(nóng)業(yè)部也于第235號(hào)公告將呋喃唑酮列為禁止使用的藥物，不得在動(dòng)物性食品中檢出[6]。所以對(duì)硝基呋喃類及其代謝物的藥物殘留檢測(cè)顯得非常有必要。目前檢測(cè)畜禽肉、水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物已有報(bào)道[7-10]，方法主要是膠體金免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[11-14]，但是由于雞蛋中蛋白和脂肪含量非常高且基質(zhì)復(fù)雜，關(guān)于雞蛋中檢測(cè)硝基呋喃類代謝物鮮少有報(bào)道[15-16]，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)主要是參考動(dòng)物源性食品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[17]。因此，建立專門針對(duì)雞蛋中硝基呋喃類代謝物殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析法顯得很有必要。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 儀器。Agilent 1290 液相色譜儀，Agilent 6460C 三重四極桿質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源）;離心機(jī)（ST 16R，賽默飛）;旋渦混合器（MS 3BS25，IKA公司）;固相萃取裝置（HHE-12B，天津恒奧）;天平（HCB602H，艾德姆）;真空泵（HPD-25，天津恒奧）;氮吹儀（TTL-DCII，北京同泰聯(lián)）;0.45 μm微孔濾膜（SCAA-104，上海安譜）;固相萃取小柱（200 mg/6cc，Oasis PRIME HLB，Waters）。

1.1.2? 藥品試劑。4種獸藥為呋喃唑酮（AOZ）、呋喃它酮（AMOZ）、呋喃妥因（AHD）、呋喃西林（SEM），對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品分別為AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SEM-[1，2-15N2;13C]，均為德國(guó)Dr.公司，標(biāo)準(zhǔn)品純度均不低于99%;甲醇為色譜純（天地），2-硝基苯甲醛、濃鹽酸、甲酸、乙酸銨均為優(yōu)級(jí)純，二甲基亞砜、乙酸乙酯、乙二胺四乙酸二納、磷酸氫二鈉、檸檬酸均為國(guó)藥分析純。

1.1.3? 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。分別精密稱取適量的4種獸藥AOZ、AMOZ、AHD、SEM標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別溶解配制成濃度為1 000 μg/mL的各藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;準(zhǔn)確吸取100 μL的各藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋定容至10 mL，配制成濃度為10 μg/mL的混標(biāo)儲(chǔ)備液，再準(zhǔn)確吸取50 μL的各藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋定容至10? mL，配制成濃度為50 μg/mL的混標(biāo)工作液;內(nèi)標(biāo)按同樣步驟配制50 μg/mL的混標(biāo)內(nèi)標(biāo)工作液。

1.1.4? Na2EDTA-McⅡ-vaine緩沖溶液配制。準(zhǔn)確稱取37.2 g乙二胺四乙酸二納（Na2EDTA·2H2O）、10.9 g磷酸氫二鈉和12.9 g檸檬酸于燒杯內(nèi)，定容至1 000? mL，調(diào)節(jié)pH至4.0，混合均勻，即可。

1.2? 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

該試驗(yàn)通過加標(biāo)回收驗(yàn)證檢驗(yàn)檢測(cè)方法，思路為設(shè)3個(gè)濃度梯度，從低到高分別為0.5、1.0、2.0 μg/kg，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行樣，另設(shè)空白樣品同時(shí)比對(duì)。

1.3? 樣品前處理過程

準(zhǔn)確稱?。?.00±0.02）g均質(zhì)雞蛋試樣，加入適量?jī)?nèi)標(biāo)，加入5? mL 0.12 mol/L鹽酸溶液，再加入200 μmL 50? mmol/L 2-硝基苯甲醛的DMSO溶液，渦旋混勻后，37 ℃水浴避光孵育16 h衍生化，冷卻至室溫，加入8? mL Na2EDTA-McⅡ-vaine緩沖溶液，渦旋混勻30 s，再加入8.00 mL乙酸乙酯，渦旋混勻， 8 000 r/min離心5 min，取上層清液備用;Prime固相萃取小柱無需活化，取上清液4.00 mL直接過柱，擠干，濾液于45 ℃下氮吹干，用1 mL甲醇-0.1%甲酸溶液（1∶9，V/V）復(fù)溶，渦旋混勻，過0.45 μm有機(jī)系微孔濾膜，供上機(jī)待測(cè)。

1.4? 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制? 精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為5、10、25、50、100、200 μg/kg各100 μL置6個(gè)不同離心管中，再精密量取混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為50 μg/kg各100 μL置上述6個(gè)離心管中，按“1.3”前處理過程操作，最終制得標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液濃度分別為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/kg，最終內(nèi)標(biāo)濃度均為5.0 μg/kg。

1.5? 色譜條件

色譜柱：Agilent C18 柱 （Rapid Resolution HD 2.1? mm×100? mm，1.8-Micron）;流 動(dòng) 相：A相為0.1% （V/V，下同）甲酸水（含5? mmol/L的乙酸銨），B相為0.1% 甲酸甲醇（含5? mmol/L的乙酸銨）;流速0.3 mL/min;進(jìn)樣量20.0 μL;時(shí)間14 min;柱溫30? ℃;梯度洗脫程序見表1。

1.6? 質(zhì)譜條件

電離模式：電噴霧正離子（ESI+）;毛細(xì)管電壓40 kV;離子源溫度350 ℃;干燥氣流速11 L/min，霧化器壓力310.26 kPa;采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式（MRM）;增加電壓（+）：100 V。質(zhì)譜采集參數(shù)見表2以及硝基呋喃類代謝物的MRM圖見圖1。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 色譜、質(zhì)譜條件的選擇

流動(dòng)相采用0.2%甲酸水-甲醇和0.1%甲酸水（含5 mmol/L的乙酸銨）-甲酸甲醇（含5 mmol/L的乙酸銨）2種體系進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.1%甲酸水（含5 mmol/L的乙酸銨）-甲酸甲醇（含5 mmol/L的乙酸銨）對(duì)4種目標(biāo)物響應(yīng)較靈敏，尤其是4種目標(biāo)物的內(nèi)標(biāo)物響應(yīng)提高較明顯，可能是流動(dòng)相體系引入乙酸銨與甲酸形成緩沖體系，這樣流動(dòng)相體系pH相對(duì)恒定，有利于目標(biāo)物的離子化效果。

該試驗(yàn)中的4種代謝物以及相對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物在正離子模式下，采用手動(dòng)優(yōu)化軟件對(duì)4種標(biāo)準(zhǔn)品單標(biāo)濃度為100 ng/mL 進(jìn)行二級(jí)子離子質(zhì)譜掃描，該研究中的4 種目標(biāo)化合物以及內(nèi)標(biāo)物詳細(xì)的碰撞能量和定性定量子離子信息見表2。

2.2? 提取、凈化條件的選擇

現(xiàn)有的硝基呋喃類代謝物殘留的前處理幾乎都是用磷酸氫二鉀進(jìn)行提取的，再采用有機(jī)溶劑乙酸乙酯進(jìn)行液液萃取。該試驗(yàn)分別進(jìn)行磷酸氫二鉀、EDTA緩沖鹽提取后結(jié)合乙酸乙酯，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)EDTA緩沖鹽結(jié)合乙酸乙酯提取結(jié)果響應(yīng)比磷酸氫二鉀結(jié)合乙酸乙酯高?？赡苁且?yàn)橄趸秽惔x和蛋白質(zhì)結(jié)合相當(dāng)穩(wěn)定，酸性條件下可能更有利于結(jié)合態(tài)的藥物提取出來。

因雞蛋樣品含有較多的脂溶性雜質(zhì)，若按肉類樣品方法提取，不進(jìn)行凈化處理，樣品會(huì)很渾濁，如白色奶樣，直接上機(jī)不僅會(huì)污染儀器，而且基質(zhì)較復(fù)雜，被檢藥物殘留響應(yīng)很低。也有報(bào)道在衍生提取前對(duì)雞蛋樣品采取有機(jī)溶劑洗滌[17]，這樣不僅需要較大量的有機(jī)試劑，而且一般的甲醇、乙醇試劑洗滌效果較差，需要采用甲醇、乙醇聯(lián)合乙醚依次洗滌才會(huì)有效果，乙醚有特殊的刺激性氣味、極易揮發(fā)，屬于易制毒管制試劑，對(duì)操作人員傷害較大。該試驗(yàn)采用HLB固相萃取小柱凈化，不僅凈化效果好，基質(zhì)干擾小，而且無需進(jìn)行樣品洗滌。

2.3? 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

從表3可以看出，4種硝基呋喃類代謝物標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.1～20.0 μg/kg線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.99。試驗(yàn)采用加標(biāo)回收的方法，以大于3倍的信噪比為檢測(cè)限，大于10的信噪比為定量限。計(jì)算得出4種硝基呋喃類代謝物各藥物殘留檢出限（LOD）為0.1 μg/kg，定量限（LOQ）為0.5 μg/kg。

2.4? 加標(biāo)回收試驗(yàn)

在雞蛋空白基質(zhì)中通過添加0.5、1.0、2.0 μg/kg濃度的4種硝基呋喃類代謝物藥物進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算回收率以及RSD。從表4可以看出，4種硝基呋喃類代謝物藥物回收率為79.85%～102.17%，RSD為1.64%～9.16%，均比較滿意，且RSD均小于15%，符合相關(guān)檢測(cè)技術(shù)規(guī)范要求。

2.5? 實(shí)際樣品檢測(cè)? 用該試驗(yàn)建立的方法對(duì)市場(chǎng)隨機(jī)采購(gòu)的20份雞蛋樣品進(jìn)行篩選測(cè)定，尚未檢測(cè)出陽(yáng)性樣品。

3? 結(jié)論

該研究通過對(duì)雞蛋樣品前處理?xiàng)l件的充分優(yōu)化改進(jìn)，建立了雞蛋中硝基呋喃類代謝物殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，樣品經(jīng)EDTA緩沖鹽結(jié)合乙酸乙酯提取、PRIME HLB凈化，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，該方法前處理過程相對(duì)簡(jiǎn)便、基質(zhì)干擾較小、重復(fù)性好、檢出限低，適用于雞蛋中4種硝基呋喃類代謝物的快速定性篩選和定量檢測(cè)分析。

參考文獻(xiàn)

[1]COOPER K M，CADDELL A，ELLIOTT C T，et al.Production and characterisation of polyclonal antibodies to a derivative of 3-amino-2-oxazolidinone，a metabolite of the nitrofuran furazolidone[J].Analytica chimica acta，2004，520（1/2）：79-86.

[2]MCCRACKEN R J，BLANCHFLOWER W J，ROWAN C，et al.Determination of furazolidone in porcine tissue using thermospray liquid chromatography-mass spectrometry and a study of the pharmacokinetics and stability of its residues[J].The analyst，1995，120 （9）：2347-2351.

[3]KAUFMANN A，BUTCHER P，MADEN K，et al.Determination of nitrofuran and? chloramphenicol residues by high resolution mass spectrometry versus tandem quadrupole mass spectrometry[J].Anal Chim Acta，2015，862：41-52.

[4]CHIU S H，SU Y L，LE A V T，et al.Nanocarbon material-supported conducting? poly（melamine） nanoparticle-modified screen-printed carbon electrodes for highly sensitive determination of nitrofuran drugs by adsorptive stripping voltammetry[J].Anal Bioanal Chem，2018，410（25）：6573-6583.

[5]VERDON E，COUEDOR P，SANDERS P.Multi-residue monitoring for the simultaneous determination of five nitrofurans（furazolidone，furaltadone，nitrofurazone，nitrofurantoine，nifursol） in poultry muscle tissue through the detection of their five major metabolites （AOZ，AMOZ，SEM，AHD，DNSAH） by liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass? spectrometry in house validation in line with commission decision[J].Analytica chimica acta，2007，586（1/2）：336-347.

[6]農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局.中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)：動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量[A].2020.

[7]桂文龍，蘇治國(guó)，徐婷婷.HPLC-MS/MS 檢測(cè)豬肉中4 種硝基呋喃類代謝物殘留[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（23）：212-215.

[8]宋興興.LC-MS/MS法檢測(cè)雞肉中硝基呋喃類代謝物的殘留[J].食品工業(yè)，2019，40（1）：308-310.

[9]王傳現(xiàn)，黃帆，王敏，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)水產(chǎn)品中殘留的硝基呋喃類藥物的代謝物[J].色譜，2013，31（3）：206-210.

[10]邢麗紅，孫偉紅，彭吉星，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定貝類組織中硝基呋喃類代謝物殘留[J].環(huán)境化學(xué)，2019，38（2）：287-296.

[11]趙正苗，羅曉琴，汪善良，等.應(yīng)用膠體金免疫層析法檢測(cè)動(dòng)物組織中呋喃西林代謝物的殘留[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2012（5）：4-5.

[12]羅杰，李健.呋喃唑酮間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA（ciELISA）檢測(cè)法的建立[J].中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，35（2）：213-218.

[13]王媛，蔡友瓊，賈東芬，等.高效液相色譜法檢測(cè)水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量[J].分析試驗(yàn)室，2009，28（12）：86-90.

[14]李丹妮，嚴(yán)鳳，張文剛，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)雞肌肉組織中硝基呋喃類代謝物殘留[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2007，26（S1）：218-221.

[15]楊婷婷，易路遙，熊雯，等.QuEChERS-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定7種蛋及蛋制品中硝基呋喃代謝物殘留的基質(zhì)效應(yīng)[J].肉類工業(yè)，2018（4）：45-50.

[16]尹暉，孫雷，葉妮，等.雞蛋中硝基呋喃類代謝物殘留的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法研究[J].中國(guó)獸藥雜志，2015，49（12）：42-46.

[17]中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所.農(nóng)業(yè)部 781號(hào)公告-4—2006：動(dòng)物源食品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測(cè)定 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2016.