賈 蓮，呂琳琳，趙 臻，孫小迷

(鞍山師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 鞍山 114007)

忍冬(LonicerajaponicaThunb.)是我國傳統(tǒng)中藥材金銀花的基源植物，具有解熱消炎、涼散風(fēng)熱、利膽保肝等功效，主要有效成分為酚酸類和黃酮類等物質(zhì)[1-2].綠原酸(chlorogenic acid)屬于酚酸類，是金銀花的主要活性成分，具有顯著的抗氧化、抗菌、抗病毒等藥理作用，應(yīng)用廣泛[3-5].

《本草綱目》曰：“忍冬，莖葉及花，功用皆同”，忍冬葉的有效成分與花基本相似，部分成分(如綠原酸和木犀草苷)含量甚至高于花蕾[6-8].但目前國內(nèi)外針對忍冬干燥花蕾的研究較為詳盡，對忍冬葉、忍冬根、忍冬果實(shí)研究較少.忍冬葉產(chǎn)量極高，作為生產(chǎn)金銀花的副產(chǎn)品，長期以來都被作為非藥用部位棄去而未得到利用.若忍冬葉含有與花蕾相近的化學(xué)成分，發(fā)揮相同或近似相同的功效，并且能夠廣泛應(yīng)用，將對忍冬未來發(fā)展起到不可估量的作用.綠原酸是《中國藥典》2015版中規(guī)定的金銀花特征化合物，因此本研究以綠原酸為指標(biāo)，考察其在忍冬葉中的最佳提取方法，采用超聲波輔助法結(jié)合正交試驗(yàn)并進(jìn)行工藝優(yōu)化，為進(jìn)一步加強(qiáng)忍冬葉資源的開發(fā)利用、擴(kuò)大忍冬的藥用部位提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

忍冬葉采集于鞍山師范學(xué)院校園內(nèi).

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院)，甲醇、磷酸為色譜純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，乙醇為分析純.

1525-2996液相色譜儀(美國Waters公司)，KQ5200B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司).

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 忍冬葉洗凈瀝干，60 ℃烘干至恒重，粉碎后過0.45 mm篩，備用.精密取0.5 g樣品粉末，置于棕色容量瓶中，采取不同料液比、乙醇濃度、超聲時(shí)間，在水浴60 ℃的條件下進(jìn)行超聲波輔助提取，抽濾后保留濾液，將殘?jiān)韵嗤绞竭M(jìn)行二次提取，合并兩次提取液.

1.2.2 液相色譜條件 色譜柱：ODS-2 Kromasil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.3%磷酸水溶液-甲醇(85∶15(V∶V))；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：327 nm；進(jìn)樣量：10 μL.

1.2.3 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置10 mL棕色容量瓶中，加入甲醇制成1 mg/mL的母液.吸取配制好的綠原酸母液0.05,0.10,0.20,0.40,0.80 mL于瓶中，再分別加入甲醇9.95,9.90,9.80,9.60,9.20 mL，配制成濃度為5,10,20,40,80 μg/mL的溶液.根據(jù)上述色譜條件檢測，記錄峰面積，以綠原酸的質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：

y=357 049x-94 331，r=0.996 4.

1.2.4 單因素試驗(yàn) 參照郭華等[9]提取方法，選取乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)：

(1)選取乙醇濃度50%、60%、70%、80%、90%，固定料液比 1∶20，提取時(shí)間 40 min；

(2)選取料液比 1∶5,1∶10,1∶15,1∶20,1∶25，固定乙醇濃度 60%，提取時(shí)間 40 min;

(3)選取提取時(shí)間20,30,40,50,60 min，固定乙醇濃度 60%，料液比 1∶20，按照 1.2.1方法提取忍冬葉中綠原酸，篩選較優(yōu)的單因素范圍.

1.2.5 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，因素與水平設(shè)計(jì)見表 1.

表1 正交因素水平表

1.2.6 綠原酸得率的計(jì)算 本實(shí)驗(yàn)計(jì)算綠原酸得率是采用楊彬等[10]在《金銀花綠原酸和木犀草苷的提取》一文中的公式：

其中m：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得綠原酸的質(zhì)量(μg)；V：提取液體積(mL)；m1：忍冬葉質(zhì)量(g).

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 采用Excel2007、正交設(shè)計(jì)助手ⅡV3.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，根據(jù)數(shù)據(jù)制作出表格及變化曲線圖.

2 結(jié)果與分析

圖1 乙醇濃度對綠原酸得率的影響

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇濃度對綠原酸得率的影響 由圖1可知，綠原酸的得率隨乙醇濃度的逐漸增加而上升，在乙醇濃度達(dá)到60%時(shí)，得率最高；當(dāng)乙醇濃度超過60%時(shí)，綠原酸得率減小.

2.1.2 料液比對綠原酸得率的影響 由圖2可知，當(dāng)料液比小于1∶20時(shí)，綠原酸得率都隨料液比的增加而提高，這是因?yàn)榱弦罕仍酱?，?xì)胞內(nèi)部的綠原酸物質(zhì)向外擴(kuò)散也越多.而當(dāng)料液比大于1∶20時(shí)，由于忍冬葉中的綠原酸是一定的，故綠原酸溶解量減小.所以采用1∶20的料液比為宜，既能保證一定的得率，又能減少后續(xù)操作難度，節(jié)省材料和能耗.

2.1.3 提取時(shí)間對綠原酸得率的影響 由圖3看出綠原酸的得率隨著時(shí)間的延長而提高，這是由于隨著浸提時(shí)間的增長，越來越多的綠原酸被溶解出來.超聲波輔助處理40 min時(shí)達(dá)到提取最大值，而后隨著超聲波輔助時(shí)間延長，綠原酸得率有所下降.

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2.在試驗(yàn)范圍內(nèi)，得到最佳組合是A3B1C3，即料液比1∶20、乙醇濃度60%、超聲時(shí)間為40 min時(shí)忍冬葉中綠原酸的得率最高，為5.34%.由極差R值分析可知，RA>RB>RC，超聲波輔助法提取忍冬葉中綠原酸，影響忍冬葉中綠原酸得率的因素主次關(guān)系依次為：料液比、乙醇濃度、超聲時(shí)間.

圖2 料液比對綠原酸得率的影響 圖3 時(shí)間對綠原酸得率的影響

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析表

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在最佳組合A3B1C3條件下，按上述步驟進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，做3組平行試驗(yàn)，結(jié)果見表3.由表3可知，樣品中綠原酸平均提取率為5.21%，且RSD為0.17%，在本優(yōu)選條件下重復(fù)試驗(yàn)的重現(xiàn)性較好，最佳提取條件得到驗(yàn)證.

表3 最佳提取條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

3 結(jié)論

本文對忍冬葉中綠原酸進(jìn)行超聲輔助提取，并用正交試驗(yàn)確定了最佳提取工藝條件：料液比1∶20、乙醇濃度60%、超聲時(shí)間為40 min.試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步加強(qiáng)忍冬葉資源的實(shí)際開發(fā)利用、擴(kuò)大忍冬的藥用部位提供科學(xué)依據(jù).