孟 健，陸麗霞，熊曉輝

(南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800)

傳統(tǒng)溶栓藥物如尿激酶、鏈激酶等具有人體內(nèi)半衰期短、口服無(wú)效、易出血等缺點(diǎn)。1987年，日本科學(xué)家Sumi等[1]從納豆食品中分離到具有強(qiáng)烈纖溶活性的物質(zhì)，并命名為納豆激酶(nattokinase，NK)，NK有望彌補(bǔ)傳統(tǒng)溶栓藥物的不足，具有較大的開(kāi)發(fā)潛能，成為新一代抗栓藥物[2-4]，也可開(kāi)發(fā)為優(yōu)良的保健食品。由于微生物種類(lèi)多，繁殖快，容易培養(yǎng)，生長(zhǎng)條件易于控制，提取工藝也較簡(jiǎn)單，且隨著老年人口增加及運(yùn)動(dòng)、飲食的影響，發(fā)生血管栓塞人數(shù)不斷增加，因此，近年來(lái)微生物源溶栓藥物的研發(fā)受到廣泛重視[5-6]。微生物溶栓藥物的研發(fā)，旨在提高藥物的醫(yī)用價(jià)值，關(guān)鍵在于提高溶栓藥物中發(fā)揮主要作用的酶活性。研究表明，適當(dāng)離子濃度對(duì)固態(tài)發(fā)酵納豆激酶活力有促進(jìn)作用，如金屬離子Ca2+、Mg2+對(duì)納豆激酶的纖溶活性的提高有不同程度的作用[7]。如劉誠(chéng)[8]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，Mg2+對(duì)酶活的提高有作用；李妍[9]經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+、Mg2+、Na+和K+會(huì)對(duì)酶活的提高有作用。已有的報(bào)道主要是研究不同離子對(duì)酶活性的影響，本文中，筆者在已有研究的基礎(chǔ)上，研究3種不同Ca2+、Mg2+源對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的影響，以確定最佳的Ca2+、Mg2+源和最佳添加量水平，獲得高酶活的納豆產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，保存于筆者所在實(shí)驗(yàn)室。

蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、營(yíng)養(yǎng)瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；NaCl(分析純，下同)、可溶性淀粉、CaCl2(食品級(jí))、 NaH2PO4、Na2HPO4、K2HPO4、KH2PO4，西隴化工股份有限公司；酵母浸膏、HCl(分析純)、NaOH(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乳酸鈣(CaC6H10O6·5H2O食品級(jí))、CaCO3(食品級(jí))，廣東汕頭市西隴化工廠；MgSO4(食品級(jí))、MgCl2(食品級(jí))、MgCO3(食品級(jí))，連云港科德化工有限公司；牛纖維蛋白(74 mg/支)、凝血酶(160 BP/瓶)、尿激酶(1 240 IU/瓶)，中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.2 儀器與設(shè)備

全溫?fù)u瓶柜，太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱、立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司設(shè)備廠；XJA-100A型高速粉碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

納豆激酶(NK)活力的測(cè)定是以其相對(duì)于尿激酶的活力單位來(lái)表示的，故需要建立尿激酶的活力單位與纖維蛋白平板溶圈大小間的相關(guān)性[10]。

以不同活力單位的尿激酶溶液為標(biāo)準(zhǔn)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液依次稀釋至6.25、12.5、25.0、50.0、100.0、150.0、200.0 IU/mL，分別用微量進(jìn)樣器各取10 μL尿激酶溶液點(diǎn)樣于制作好的纖維蛋白平板上。放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)18 h，然后分別測(cè)定纖維蛋白溶解圈的2個(gè)垂直直徑，計(jì)算其乘積近似為纖維蛋白溶解圈的面積，并根據(jù)尿激酶的活力單位與纖維蛋白溶解圈的面積繪制酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 納豆的制備

洗凈后的豆子與水按1∶ 1的體積比浸泡適當(dāng)時(shí)間后，加入2%可溶性淀粉，0.5%酵母膏，攪拌至充分溶解后，調(diào)節(jié)pH(7.2～7.4)。在121 ℃下滅菌40 min，滅菌結(jié)束后取出，冷卻至室溫后，接種5%種子培養(yǎng)液，攪拌均勻后，37 ℃下發(fā)酵培養(yǎng)24 h，發(fā)酵結(jié)束后在冷凍干燥機(jī)上預(yù)凍結(jié)，凍結(jié)完成后干燥36 h即可[11-12]。

1.3.3 納豆激酶活力測(cè)定

按1.3.2節(jié)的方法制備納豆，發(fā)酵結(jié)束后的納豆經(jīng)打磨成糊粉狀，稱(chēng)取2 g糊粉狀納豆溶于18 mL生理鹽水中，適當(dāng)稀釋即為粗酶樣液。微量進(jìn)樣器取待測(cè)NK樣液10 μL，點(diǎn)樣于纖維蛋白平板上，同時(shí)將一定單位的標(biāo)準(zhǔn)尿激酶溶液點(diǎn)樣于纖維蛋白平板上作為對(duì)照，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)18 h，然后分別測(cè)定纖維蛋白溶解圈的2個(gè)垂直直徑，計(jì)算其乘積近似為纖維蛋白溶解圈的面積。

溶解圈面積直接反映了酶活力的相對(duì)大小，將NK溶解圈面積與標(biāo)準(zhǔn)的尿激酶UK的溶解圈面積相比較，得出NK相當(dāng)于尿激酶活性單位(IU/mL)。NK活性計(jì)算見(jiàn)式(1)，納豆粉的酶活性計(jì)算見(jiàn)式(2)。

(1)

(2)

式中：m表示稱(chēng)取糊粉狀納豆的質(zhì)量(g)，V表示納豆粉與生理鹽水溶液的總體積(mL)。

1.3.4 活菌數(shù)測(cè)定方法

取4 g發(fā)酵結(jié)束后的納豆置于裝有36 mL無(wú)菌生理鹽水的三角瓶中，振蕩混勻后，制成1∶ 10的樣品液，移液槍吸取1 mL樣液依次做10倍系列稀釋?zhuān)x用適宜的稀釋倍數(shù)，吸取1 mL稀釋液于無(wú)菌平板上，平板倒入適量的培養(yǎng)基液，迅速混勻，做3個(gè)平行培養(yǎng)皿。待凝固后倒置，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。選用菌落數(shù)在30～300的培養(yǎng)皿，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[13]。

1.3.5 不同Ca2+及添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的影響

以CaCl2、CaCO3、CaC6H10O6·5H2O為Ca2+源，配制不同添加量水平的豆子樣液，于250 mL的三角瓶中進(jìn)行搖床發(fā)酵，同時(shí)做平行，考察不同Ca2+源及添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的影響[14]。培養(yǎng)基其他成分、培養(yǎng)條件同1.3.2節(jié)納豆的制備。以不添加離子源的實(shí)驗(yàn)組為空白組。Ca2+的添加量水平按混合后豆子與水質(zhì)量總和的質(zhì)量百分比計(jì)算。

1.3.6 不同Mg2+及添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的影響

以MgCl2、MgCO3、MgSO4分別為Mg2+源，具體方法、培養(yǎng)條件參照方法1.3.5節(jié)。

1.3.7 納豆的感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)人員12人，得分是去掉1個(gè)最高分和1個(gè)最低分取平均分。不同Ca2+源、Mg2+源制成的納豆通過(guò)產(chǎn)品的顏色、香氣、滋味、組織形態(tài)4個(gè)指標(biāo)來(lái)進(jìn)行感官評(píng)定，每個(gè)指標(biāo)滿(mǎn)分為10分。感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[15]見(jiàn)表1。

表1 納豆產(chǎn)品的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與討論

2.1 酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線

尿激酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for urokinase

從圖1中可以看出，尿激酶的酶活與其溶解圈的面積成線性關(guān)系，其方程為：y=0.004 3x+0.136 9(x表示納豆激酶相對(duì)酶活性，y表示平板溶解圈的面積)，相關(guān)系數(shù)R2=0.993 4。根據(jù)此線性方程，可以計(jì)算出納豆中納豆激酶的相對(duì)尿激酶活性。

2.2 不同Ca2+及添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的影響結(jié)果

不同Ca2+及其不同添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的影響如圖2～4所示。

圖2 不同CaCO3添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn) 納豆激酶及菌體量的影響Fig.2 Effects of different additions of CaCO3 on the growth of nattokinase and amount of bacteriaby solid-state fermentation

由圖2可以看出：隨著CaCO3添加量的增加，納豆激酶活力和菌體量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)CaCO3添加量0.4%時(shí)，此時(shí)納豆激酶活性達(dá)到9 100 IU/g，同時(shí)菌體量達(dá)到6.3×107CFU/g；之后，隨著CaCO3添加量的增加，納豆激酶活性、菌體量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，表明以CaCO3作為Ca2+源，最佳添加量為0.4%，在該添加量下，納豆激酶活性較空白組的酶活性(6 260 IU/g)相比提高了45%。

圖3 不同CaCl2添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn) 納豆激酶及菌體量的影響Fig.3 Effects of different additions of CaCl2 on the growth of nattokinase and amount of bacteria by solid-state fermentation

由圖3可以看出：CaCl2作為Ca2+源，CaCl2添加量對(duì)納豆激酶活性、菌體量有一定的影響。CaCl2添加量水平低于0.04%，利于酶的分泌合成、菌體的生長(zhǎng)、繁殖；當(dāng)CaCl2添加量繼續(xù)增加，納豆激酶活性、菌體量逐漸下降。表明CaCl2作為Ca2+源，最佳的添加量為0.04%，此時(shí)的納豆激酶活性達(dá)到7 786 IU/g，比空白組的酶活力4 960 IU/g提高了57%，菌體量達(dá)到5.4×107CFU/g。

圖4 不同乳酸鈣添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn) 納豆激酶及菌體量的影響Fig.4 Effects of different additions of calcium lactate on the growth of nattokinase and amount of bacteria by solid-state fermentation

由圖4可以看出：乳酸鈣作為Ca2+來(lái)源，隨著添加量的增加，納豆激酶活性和菌體量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)添加量為0.3%時(shí)，納豆激酶活性8 453 IU/g，比空白組的酶活性6 260 IU/g提高了35%，菌體量達(dá)到8.6×107CFU/g，此時(shí)的酶活性最高、菌體量最多，利于發(fā)酵過(guò)程中酶活的分泌合成，菌體的生長(zhǎng)繁殖。

3種最佳添加量水平的Ca2+源制備的納豆，在酶活提高效果方面，CaCO3、CaCl2制備的納豆激酶活性提高率高于乳酸鈣制備的納豆，表明在發(fā)酵過(guò)程中，CaCO3、CaCl2作為Ca2+源更能促進(jìn)納豆激酶的分泌合成；從菌體量方面來(lái)看，菌體量總數(shù)差異不大。選用0.04% CaCl2為Ca2+源為宜，酶活提高效果最高。

2.3 不同Mg2+及添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的影響結(jié)果

不同Mg2+及不同添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的影響如圖5～7所示。

圖5 不同MgCl2添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn) 納豆激酶及菌體量的影響Fig.5 Effects of different content of MgCl2 on the growth of nattokinase and amount of bacteria by solid-state fermentation

由圖5可以看出：以MgCl2作為Mg2+源，隨著MgCl2添加量的增加，納豆激酶活性總體上有所提高，菌體量逐漸增加。當(dāng)添加量為0.06%時(shí)，納豆激酶活性相對(duì)較高，達(dá)到6 040 IU/g，比空白組的酶活性4 981 IU/g提高了21%，菌體量達(dá)到9.6×107CFU/g；MgCl2添加量超過(guò)0.08%之后，納豆激酶活性較空白組相比有所下降，菌體量降低，同時(shí)MgCl2添加量低于0.04%，對(duì)納豆激酶活性、菌體量提高效果不明顯。說(shuō)明以MgCl2作為Mg2+源，MgCl2適宜的添加量范圍為0.04%～0.08%?？紤]到菌體量、生產(chǎn)成本因素，選用0.06% MgCl2為Mg2+源。

圖6中，以MgCO3作為Mg2+源，隨著MgCO3添加量的增加，納豆激酶活性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。MgCO3添加量達(dá)到0.16%時(shí)，納豆激酶活性最高可達(dá)8 704 IU/g，比空白組的酶活性6 188 IU/g提高了40%，菌體量達(dá)到4.8×107CFU/g。不過(guò)，隨著添加量的增加，菌體量逐漸降低，說(shuō)明以MgCO3作為Mg2+源發(fā)酵制備納豆，對(duì)菌體的生長(zhǎng)繁殖有一定的抑制作用。

圖6 不同MgCO3添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn) 納豆激酶及菌體量的影響Fig.6 Effects of different content of MgCO3 on the growth of nattokinase and amount of bacteria by solid-state fermentation

從圖7中可以看出：以MgSO4作為Mg2+源，隨著添加量的增加，納豆激酶活性和納豆菌呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，MgSO4添加量達(dá)到0.72%時(shí)，此時(shí)納豆激酶活性達(dá)到10 591 IU/g，比空白組的酶活性6 188 IU/g提高了71%，菌體量達(dá)到7.8×107CFU/g，效果最佳。之后，隨著添加量的繼續(xù)增加，納豆激酶活性、菌體量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，表明當(dāng)以MgSO4作為Mg2+源，MgSO4最佳添加量是0.72%。

圖7 不同MgSO4添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn) 納豆激酶及菌體量的影響Fig.7 Effects of different content of MgSO4 on the growth of nattokinase and amount of bacteria by solid-state fermentation

3種最佳添加量水平的Mg2+源制備的納豆，在酶活提高效果方面，MgSO4、MgCO3制備的納豆激酶活明顯高于MgCl2制備的納豆，不過(guò)MgCO3作為Mg2+源發(fā)酵制備納豆，對(duì)菌體的生長(zhǎng)繁殖有一定的抑制作用。選擇0.72% MgSO4為Mg2+源為宜，納豆激酶酶活提高效果最好。

2.4 納豆的感官評(píng)價(jià)結(jié)果

不同離子源制備的納豆產(chǎn)品通過(guò)產(chǎn)品的顏色、香氣、滋味、組織形態(tài)4個(gè)指標(biāo)來(lái)進(jìn)行感官評(píng)定，每個(gè)指標(biāo)滿(mǎn)分為10分，結(jié)果如表2。

表2 不同離子源制備的納豆感官評(píng)價(jià)

不同離子源制備的納豆產(chǎn)品在感官上有所差異。由表2可以看出：以不同離子源制備的納豆制備感官評(píng)分總分與空白組相比相差不大。不過(guò)在單項(xiàng)評(píng)分上有明顯的差異。在香氣方面，以CaC6H10O6·5H2O為Ca2+源制備的納豆，有納豆特有的香氣，而CaCO3、CaCl2、空白組制備的納豆略帶有氨味；在組織形態(tài)方面，CaCl2、CaC6H10O6·5H2O制備的納豆有很多的黏細(xì)絲，而CaCO3、空白組制備的納豆的黏細(xì)絲相對(duì)較少；在納豆顏色和滋味方面，3種Ca2+制備的納豆與空白組之間相差不大。不同Mg2+源制備的納豆在納豆顏色方面，都呈黃色、微紅，彼此相差不大，和空白組制備的納豆顏色基本相符；在香氣方面，MgCO3制備的納豆略帶氨味，明顯不如MgCl2、MgSO4、空白組制備的納豆有特有的香氣；在滋味方面，MgCl2制備的納豆不如MgCO3、MgSO4、空白組制備的納豆酥軟、濕滑，口感不佳；在組織形態(tài)方面，MgSO4制備的納豆相比于其他2種Mg2+源、空白組制備的納豆，有較多細(xì)長(zhǎng)的黏絲。綜合考慮上述研究的納豆激酶活提高效果、菌體量、納豆的感官評(píng)價(jià)結(jié)果、生產(chǎn)成本等因素，選用0.04% CaCl2為Ca2+源，0.72% MgSO4為Mg2+源發(fā)酵制備納豆。

3 結(jié)論

綜合考慮納豆功能性成分、納豆感官評(píng)價(jià)結(jié)果、節(jié)約成本等方面，得出CaCl2為最佳Ca2+源，最佳添加量0.04%，制備的納豆激酶活性達(dá)到7 786 IU/g，相比空白組酶活性提高了57%，菌體量為5.4×107CFU/g；MgSO4為最佳Mg2+源，最佳添加量0.72%，制備的納豆激酶活性達(dá)到10 591 IU/g，相比空白組酶活性提高了71%，菌體量達(dá)到7.8×107CFU/g。感官評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，以不同離子源制備的納豆制備感官評(píng)分總分與空白組相比無(wú)顯著差異，單項(xiàng)指標(biāo)上有差異。CaCl2制備的納豆雖略帶有氨味，但有很多的黏細(xì)絲；MgSO4制備的納豆酥軟、濕滑，口感較佳，且有很多的黏細(xì)絲。