焦雪茜，張 梁，胡柏藩，胡柏剡，丁重陽(yáng)，石貴陽(yáng)

(1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2. 浙江新和成股份有限公司，浙江 新昌 312500)

輔酶Q10，別名泛醌(Ubiquinone)，是一種脂溶性天然抗氧化劑，作為呼吸鏈中重要的遞氫體主要分布于線粒體內(nèi)膜上[1]，分子量為863.36，分子式為C59H90O4。輔酶Q10有還原型和氧化型之分，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的主要是氧化型 Q10。輔酶Q10在醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)應(yīng)用廣泛[2-6]。隨著輔酶Q10的應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓寬，市場(chǎng)需求逐年增長(zhǎng)，其生產(chǎn)方法和工藝的開發(fā)和優(yōu)化引起了研究者的廣泛興趣。目前，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝主要有微生物發(fā)酵法、生物提取法、細(xì)胞培養(yǎng)法和化學(xué)合成法[7]，其中最主要的為微生物發(fā)酵法和茄尼醇合成法。輔酶Q10的全合成難度很大，如以香葉醇為原料，經(jīng)多次耦合構(gòu)建異戊二烯側(cè)鏈，再將側(cè)鏈銜接到輔酶Q10母核上，全合成得到輔酶Q10。全合成法工藝路線長(zhǎng)，過(guò)程復(fù)雜，收率低，反應(yīng)條件苛刻，很難實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化[8]。相比之下，發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶Q10成本較低，有實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。Yoshida等[9]通過(guò)對(duì)R.sphaeroidesKY-4113進(jìn)行誘變得到一株綠色高產(chǎn)菌株Co-22-11，其產(chǎn)量達(dá)350 mg/L。與國(guó)外的研究相比，國(guó)內(nèi)水平略有欠缺。吳祖芳等[10]通過(guò)對(duì)放射根瘤菌WSH2601在7 L發(fā)酵罐上進(jìn)行發(fā)酵研究發(fā)現(xiàn)，輔酶Q10的最大產(chǎn)量達(dá)52.4 mg/L。李梅等[11]以CPU0402發(fā)酵輔酶Q10產(chǎn)量達(dá)87 mg/L。李繼揚(yáng)等[12]通過(guò)耐受前體及結(jié)構(gòu)類似物篩選到的高產(chǎn)菌株產(chǎn)量可達(dá)120 mg/L。

一般來(lái)說(shuō)，輔酶Q10菌株的產(chǎn)量和傳代穩(wěn)定性較難同時(shí)滿足，并且若實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，需進(jìn)一步提高菌株的產(chǎn)量。離子束誘變技術(shù)借助離子輻照和單離子束精確定位輻照等物理平臺(tái)，結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于改良微生物生產(chǎn)菌種。離子束誘變的原理可以概括為離子束能量傳遞、電荷傳遞、質(zhì)量沉積等多種效應(yīng)，從而使得受體目標(biāo)體內(nèi)遺傳物質(zhì)發(fā)生改變。離子束誘變育種具有損傷輕、誘變范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[13]。因此，通過(guò)誘變方法獲取產(chǎn)量和穩(wěn)定性均較為理想的菌株具有較強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。本文中，筆者對(duì)一株產(chǎn)輔酶Q10的菌株進(jìn)行了紫外誘變及離子束誘變，以期篩選獲得較為理想的輔酶Q10高產(chǎn)菌株。

1 材料與方法

1.1 菌種

根癌土壤桿菌(Rhizobiumradiobacter)，保藏于江南大學(xué)生物資源與生物轉(zhuǎn)化研究室。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

斜面或平板培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏10，NaCl 5，瓊脂20，pH 7.2；斜面或平板30 ℃培養(yǎng)24 h。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖3，酵母膏5，(NH4)2SO43，KH2PO40.6，K2HPO40.4，NaCl 2，pH 7.2；250 mL種子瓶裝液量為30 mL，于30 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，(NH4)2SO44，玉米漿10，NaCl 2，KH2PO42，MgSO4·7H2O 3，pH 7.2；250 mL發(fā)酵瓶裝液量為30 mL，種子接種量4%，于30 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。

1.3 誘變方法

1.3.1 紫外誘變方法

首先將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體制成細(xì)胞密度為108個(gè)/mL的菌懸液，然后取菌懸液用紫外線照射，照射時(shí)間依需要調(diào)整。取誘變后菌懸液30 ℃避光培養(yǎng)，待菌長(zhǎng)出后計(jì)算誘變致死率。

1.3.2 離子束誘變方法

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體制成細(xì)胞密度為109～1010個(gè)/mL的菌懸液，然后取菌懸液制成菌膜，放入離子注入機(jī)的靶室脈沖，注入能量為10 keV的N+，注入劑量根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整。

1.4 檢測(cè)方法

采用C18色譜柱(250 mm×4.6 mm)，流動(dòng)相V(甲醇)∶V(無(wú)水乙醇)=1∶ 1；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm；柱溫34 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 快速篩選方法的確定

2.1.1 維生素K3(VK3)抗生素突變株的篩選

VK3是輔酶Q10的結(jié)構(gòu)類似物，通過(guò)篩選抗VK3的突變株，可以解除輔酶Q10對(duì)合成途徑的反饋調(diào)節(jié)[14]。VK3是脂溶性物質(zhì)，難溶于水，因此采用有機(jī)溶劑N，N-二甲基甲酰胺(DMF)對(duì)其進(jìn)行溶解。

首先確定DMF對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響。將對(duì)數(shù)期的菌懸液涂布于DMF體積分?jǐn)?shù)分別為0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%和2.8%的平板上，30 ℃培養(yǎng)。不同體積分?jǐn)?shù)DMF對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響見表1。由表1可知：DMF體積分?jǐn)?shù)在0～2.0%時(shí)對(duì)菌體的生長(zhǎng)基本上沒有影響，而體積分?jǐn)?shù)超過(guò)2.0%時(shí)會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯抑制，因此，DMF的體積分?jǐn)?shù)上限定為2.0%。

其次進(jìn)行VK3最小抑制濃度的確定。將含有VK3的DMF母液加入到培養(yǎng)基中，制得VK3質(zhì)量濃度在0～0.06 g/L的梯度平板，然后將對(duì)數(shù)期菌液涂布于上述平板，30 ℃培養(yǎng)，通過(guò)菌落生長(zhǎng)情況確定抗性平板中VK3的臨界濃度，結(jié)果見表2。

表1 DMF濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

注：“+”代表有菌落生長(zhǎng)，“+”的數(shù)量代表菌落數(shù)量的多少。

表2 維生素K3(VK3)對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

注：“+”代表有菌落生長(zhǎng)，“+”的數(shù)量代表菌落數(shù)量的多少 ，“-”代表無(wú)菌落生長(zhǎng)。

由表2可知，當(dāng)VK3質(zhì)量濃度在0.02～0.035 g/L時(shí)，平板上有菌落生長(zhǎng)，且隨著VK3濃度的增加，菌落數(shù)逐漸減少；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.04 g/L時(shí)，由于受到較高濃度VK3的抑制作用，平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)。因此，確定篩選抗結(jié)構(gòu)類似物突變株所用抗性平板中VK3質(zhì)量濃度為0.04 g/L。

2.1.2 糖苷類抗生素突變株的篩選

糖苷類抗生素可作用于呼吸鏈，因此可利用糖苷類抗生素一族里的丁胺卡那霉素和硫酸慶大霉素作為篩選因子，從而減少篩選的工作量，提高篩選效率。

首先進(jìn)行丁胺卡那霉素(amikacin,Ami)最小抑制濃度的確定。取菌懸液涂布于含有0～35 mg/L Ami的平板上，以未加藥物的平板為對(duì)照，通過(guò)菌落生長(zhǎng)情況確定最小抑制濃度，結(jié)果見表3。

表3 丁胺卡那霉素對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

注： “+”代表有菌落生長(zhǎng)，“+”的數(shù)量代表菌落數(shù)量的多少 ，“-”代表無(wú)菌落生長(zhǎng)。

由表3可知，隨著Ami濃度的增加，菌體的生長(zhǎng)受到抑制逐漸加重，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到25 mg/L時(shí)，沒有菌落生長(zhǎng)。因此，確定Ami的最小抑制質(zhì)量濃度為25 mg/L。

然后對(duì)硫酸慶大霉素(Gen)臨界濃度進(jìn)行確定。取菌懸液涂布于含有0～9.6 mg/L Gen 的平板上，以未加藥物的平板為對(duì)照，通過(guò)菌落生長(zhǎng)情況確定最小抑制濃度，結(jié)果見表4。

表4 硫酸慶大霉素對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

注：“+”代表有菌落生長(zhǎng)，“+”的數(shù)量代表菌落數(shù)量的多少 ，“-”代表無(wú)菌落生長(zhǎng)。

由表4可知，隨著Gen濃度的增加，菌體的生長(zhǎng)抑制逐漸加重，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到4.8 mg/L時(shí)，沒有菌落生長(zhǎng)。因此，確定Gen的最小抑制質(zhì)量濃度為4.8 mg/L。

2.2 誘變條件的確定

2.2.1 紫外誘變時(shí)間的確定

采用10、15、20、25和30 s這5組紫外照射時(shí)間對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變，通過(guò)菌落計(jì)數(shù)得到誘變致死曲線(圖1)，并進(jìn)行不同紫外誘變時(shí)間下的正負(fù)突變率計(jì)算(圖2)。由圖1和圖2可知，由于致死率過(guò)高或過(guò)低，誘變效果均不太理想。當(dāng)誘變時(shí)間為15 s時(shí)，正突變率較高，而負(fù)突變率相對(duì)較低。因此，選擇致死率在80%～90%的15 s作為下一步的誘變時(shí)間。

圖1 不同紫外誘變時(shí)間下的致死率Fig.1 Lethality rate in different UV mutation times

圖2 不同紫外誘變時(shí)間下的正負(fù)突變率Fig.2 Positive and negative mutation rates in different UV mutation times

2.2.2 離子束注入劑量的確定

采用離子注入對(duì)微生物進(jìn)行誘變育種是一種較為常見的誘變方法，脈沖注入能量10 keV的N+，注入劑量選擇2.5×1014、5×1014、10×1014、15×1014、20×1014、25×1014和30×1014ion/cm27組對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行離子注入。通過(guò)菌落計(jì)數(shù)得到離子束誘變的存活曲線如圖3所示。

圖3 不同離子束注入劑量下的存活率Fig.3 Survival rate in different ion implantation

由圖3可以看出，存活率隨著注入劑量的增加急劇下降，當(dāng)注入劑量大于5×1014ion/cm2時(shí)，存活率又開始緩慢增加，20×1014ion/cm2時(shí)存活率達(dá)到一個(gè)相對(duì)較高的點(diǎn)，隨之又緩慢下降，存活曲線基本符合先下降后上升再下降的“馬鞍型”。

隨機(jī)挑選各個(gè)注射劑量的平板上長(zhǎng)出的菌落，通過(guò)搖瓶發(fā)酵瓶檢測(cè)輔酶Q10的產(chǎn)量，對(duì)它們的突變率情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖4。

圖4 不同離子束注入劑量下的突變率Fig.4 Mutation rate in different ion implantation

由圖4可知，大多數(shù)劑量下，菌株的負(fù)突變率較正突變高，而5×1014和20×1014ion/cm2這兩個(gè)劑量下菌株的正突變率卻較高。參照存活率曲線，正突變較高時(shí)恰好為存活曲線的兩個(gè)拐點(diǎn)。相比之下，高劑量離子束對(duì)微生物作用更加劇烈，突變率也較高，產(chǎn)生期望結(jié)果的幾率相對(duì)更大。因此，選擇20×1014ion/cm2作為進(jìn)一步誘變的劑量。

2.3 誘變及篩選結(jié)果

2.3.1 第一輪紫外誘變

將紫外照射15 s的菌懸液涂布含有VK3的抗性平板，待菌落長(zhǎng)出后挑選了125株菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)深綠色菌落產(chǎn)量較高，隨著菌落顏色變淺，輔酶Q10的產(chǎn)量也隨之降低。因此，也可以將菌株的顏色作為一種初篩的手段，從而減少篩選的工作量(由于此項(xiàng)工作工作量很大，太多圖片就不附在文章里)。經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩得到一株產(chǎn)量相對(duì)較高、編號(hào)為10-18的菌株(78.1 mg/L)作為下一步誘變的出發(fā)菌株K-1，與出發(fā)菌株K-0(63.7 mg/L)相比，產(chǎn)量提高了22.6%。

2.3.2 第二輪紫外誘變及離子束誘變

將菌株10-18制成菌懸液，紫外照射15 s，適當(dāng)稀釋后涂布含有丁胺卡那霉素和硫酸慶大霉素的抗性平板(兩種平板分別標(biāo)記為Amir和Genr)，在Amir平板上挑取了52株菌，通過(guò)初篩和復(fù)篩，得到4株相對(duì)高產(chǎn)菌株K-2、K-18、K-52、K-53，其中編號(hào)為K-53的菌株產(chǎn)量達(dá)到了101.1 mg/L。對(duì)Genr平板上挑取的56株菌進(jìn)行初篩和復(fù)篩，得到高產(chǎn)菌株Q-18、Q-34、Q-40和Q-52，其中編號(hào)為Q-18的菌株產(chǎn)量最高為104.7 mg/L。上述篩選結(jié)果見表5。出發(fā)菌株編號(hào)為K-0。

表5 紫外誘變獲得Amir和Genr高產(chǎn)菌株

由表5可知，經(jīng)過(guò)兩次紫外誘變，并結(jié)合VK3和糖苷類抗生素的抗性篩選，輔酶Q10的產(chǎn)量有了較大幅度的提高。其中，篩選得到的具有VK3抗性(VK3r)+Amir的突變株K-53與VK3r+Genr的突變株Q-18產(chǎn)量與出發(fā)菌株相比分別提高了58.7%和64.4%。由于兩種篩選方法均有明顯效果，因此，按上述方法繼續(xù)誘變和篩選應(yīng)該能夠進(jìn)一步提高出發(fā)菌株的產(chǎn)量。并且，篩選具有Amir和Genr雙重抗性的突變株也是今后工作的重點(diǎn)。

菌株10-18預(yù)處理后脈沖注入能量為10 keV的N+，注入劑量為20×1014ion/cm2。平板培養(yǎng)后，挑取256株菌，通過(guò)搖瓶初篩和復(fù)篩，得到4株編號(hào)為Y80-58-2、Y80-88-1、G60-43-1、Y60-42-2的高產(chǎn)菌，結(jié)果見表6。與10-18(78.1 mg/L)相比分別提高了35.5%、25.7%、24.6%和24.2%。

表6 離子束誘變高產(chǎn)菌株

2.3.3 高產(chǎn)菌株誘變選育譜系及傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

通過(guò)不同的誘變方法相結(jié)合，分別獲得了K-53、Q-18、和Y80-58-2這3株較高產(chǎn)的輔酶Q10產(chǎn)生菌株，高產(chǎn)菌株誘變圖譜如圖5所示。將上述3株菌株在斜面上連續(xù)轉(zhuǎn)接5代，并將各代的菌株搖瓶發(fā)酵檢測(cè)輔酶Q10的產(chǎn)量，結(jié)果如圖6所示。圖6表明各代輔酶Q10的產(chǎn)量基本穩(wěn)定，說(shuō)明K-53、Q-18和Y80-58-2的遺傳穩(wěn)定性較好。

圖5 Rhizobium radiobacter BnSO1 誘變高產(chǎn) 菌株的選育譜系Fig.5 Mutation breeding of coenzyme Q10 high-yield strains from Rhizobium radiobacter BnSO1

圖6 傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Experiment results of passage stability

綜上可知，采用結(jié)構(gòu)類似物和糖苷類抗生素作為篩選因子較為可行，既達(dá)到了預(yù)期的目的，又降低了篩選的工作量。紫外線和離子束雙重誘變獲得的突變株Y80-58-2產(chǎn)量達(dá)105.8 mg/L，比單純使用紫外誘變產(chǎn)量高，且傳代穩(wěn)定，這也提示筆者在以后的工作中，需要更多的采用復(fù)合誘變的方法。盡管本工作所采用的方法較理想地實(shí)現(xiàn)了預(yù)期目的，但是建立更有效的高通量篩選方法，以及如何進(jìn)一步提高產(chǎn)量，仍需要筆者付出更大的努力。

3 結(jié)論

通過(guò)紫外誘變和離子束誘變篩選輔酶Q10高產(chǎn)菌株，根據(jù)所建立的篩選方法，成功地獲得了3株高產(chǎn)菌株。首先對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變獲得了具有維生素K3抗性的突變株10-18，產(chǎn)量提高了22.6%。繼續(xù)對(duì)10-18紫外誘變，又獲得了具有丁胺卡那霉素抗性的突變株K-53和具有硫酸慶大霉素抗性的突變株Q-18，產(chǎn)量分別提高了58.7%和64.4%。同時(shí)對(duì)10-18采用N+離子束誘變，得到的一株突變株Y80-58-2，產(chǎn)量為105.8 mg/L，與出發(fā)菌株相比產(chǎn)量提高了66.1%。最后從搖瓶小試結(jié)果看，本階段工作獲得的突變株產(chǎn)量在國(guó)內(nèi)處于中等以上水平。優(yōu)化篩選方法，并且通過(guò)全自動(dòng)發(fā)酵罐實(shí)時(shí)控制發(fā)酵條件提高產(chǎn)物產(chǎn)量是筆者下一步的工作重點(diǎn)。