吳超逸，周麗婷，黃瑞，吳淑燕

蘇州大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學與生物科學學院， 蘇州 215123

由細菌、病毒、真菌等多種病原微生物所致的感染性疾病一直嚴重威脅著人類的健康，其中細菌所致感染盡管應用抗生素使之病死率下降，然而耐藥菌的不斷出現(xiàn)、新現(xiàn)和再現(xiàn)傳染病的流行仍然是人類健康的重大威脅[1]。細菌入侵后，機體會產(chǎn)生積極的免疫應答來抵御或消滅細菌，其中程序性細胞死亡(programmed cell death, PCD)在這一過程中具有重要作用。新近發(fā)現(xiàn)的Gasdermin (GSDM)家族被證實能通過參與PCD過程而影響細菌感染的發(fā)展，本文就其研究現(xiàn)狀進行總結。

1 細菌感染與抗細菌天然免疫

天然免疫是宿主在進化過程中形成的天然防御機制，是負責監(jiān)視和清除致病菌的 “第一道防線”，主要由物理屏障、化學屏障、微生物屏障、吞噬細胞、免疫分子等組成，其中吞噬細胞在天然免疫中起關鍵性作用。吞噬細胞主要分為中性粒細胞和單核-巨噬細胞。吞噬細胞能通過游走接近感染區(qū)域，再依靠不同的Toll樣受體識別不同的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，之后將致病菌吞入形成吞噬體，并與溶酶體融合成為吞噬溶酶體，進而殺滅致病菌[2]。然而，當細菌的毒力較強，吞噬細胞無法完全殺滅被吞噬的細菌時，吞噬細胞會發(fā)生細胞凋亡(apoptosis)或細胞焦亡(pyroptosis)等PCD。細菌感染分為胞內(nèi)菌和胞外菌感染，針對胞外菌感染，天然免疫主要依靠吞噬細胞來殺滅和清除。而胞內(nèi)菌感染時，有些胞內(nèi)菌在被吞噬細胞吞噬時會采取不同的策略抵抗或阻礙宿主吞噬細胞的吞噬，甚至在被吞噬細胞吞噬后，仍能積極抵抗殺傷作用，在其中生存和繁殖，這一現(xiàn)象被稱為不完全吞噬(incomplete phagocytosis)。胞內(nèi)菌避免被吞噬細胞殺傷的策略一般有：①在吞噬體與溶酶體融合之前，胞內(nèi)菌從吞噬體中逃逸至細胞質內(nèi)無殺傷物質存在的區(qū)域，避免進入吞噬溶酶體[2]。②阻止吞噬體與溶酶體融合，在吞噬體內(nèi)生存。③阻止吞噬溶酶體酸化，不引發(fā)呼吸爆發(fā)(respiratory burst)，免受其產(chǎn)生的反應性氧中介物等強氧化物質的殺傷。④產(chǎn)生過氧化氫酶及超氧化物歧化酶，有效清除H2O2、OH-和O2-，在吞噬溶酶體中生存。⑤合成酪氨酸磷酸酯酶和絲氨酸激酶[3]，這兩種酶的作用分別是去磷酸化和磷酸化，它們共同調節(jié)細胞生命活動中的磷酸化水平[4]，而磷酸化水平的變化涉及生命活動中許多信號通路的激活或關閉，細菌將這兩種酶注入吞噬細胞內(nèi)使其吞噬功能喪失[2]。細菌感染造成的損傷不但與細菌的毒力有關，而且與宿主的免疫抵抗能力也有關系，在細菌與宿主相互作用過程中，GSDM家族成員參與其中，并起到了關鍵作用。

2 GSDM家族與抗細菌天然免疫

2.1 GSDM家族概況

GSDM家族是最近被發(fā)現(xiàn)的有關PCD的蛋白家族，人類與鼠類中的GSDM家族成員稍有不同(表1)。在人類GSDM家族中，成員主要分為6類，分別為Gasdermin A(又名GSDMA或GSDM1)，Gasdermin B(又名GSMDB、GSDML或PRO2521)，Gasdermin C(又名GSDMC或MLZE)，Gasdermin D(又名GSDMD、GSDMDC1或DFNA5L)，Gasdermin E(又名GSDME或DFNA5)和Pejvakin(又名GSDMF、DFNB59或PJVK)。而在小鼠GSDM家族中，沒有GSDMB存在，但卻擁有3種GSDMA的同系物(GSDMA1、GSDMA2和GSDMA3)和4種GSDMC的同系物(GSDMC1、GSDMC2、GSDMC3和GSDMC4)[5]。

2.1.1 GSDM家族成員在機體中的分布①人GSDMA主要在食管、下消化道、乳腺、皮膚和胃中表達；小鼠GSDMA1在皮膚和胃賁門的鱗狀上皮細胞中表達，GSDMA2在皮膚中表達，GSDMA3在胃上皮細胞中表達[6]。②GSDMB在哮喘患者肺支氣管上皮、食管上皮和胃腸道上皮均有特異性表達[7]。③編碼人GSDMC的基因在氣管、脾臟和胃食管上皮細胞中表達，而在小鼠中，編碼GSDMC的基因在胃、小腸、盲腸和結腸中表達[7]。④人GSDMF表達于毛細胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)支持細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元、內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)細胞和神經(jīng)元胞體[8]。小鼠GSDMF多表達于腦、眼、耳、肺、心臟、肝臟、腎和小腸[9]。⑤GSDMD多在人食管、胃和腸道中表達，在小鼠腸道中也有表達。GSDMD不僅在宿主防御中發(fā)揮作用，并且關于其介導焦亡的作用常被報道[6]。⑥人GSDME在腦、心、腎、胎盤中均有表達，小鼠GSDME表達于耳蝸、胸腺、結腸、肺、腦、脾和小腸[10]。GSDME在細胞凋亡和焦亡中也發(fā)揮著重要作用[11]。

2.1.2 GSDM家族的主要生物學功能①人GSDMA和小鼠GSDMA3的氨基端(N-terminal，N端)結構域在293T等細胞中過表達時會在質膜上打孔，產(chǎn)生細胞焦亡特征。當GSDMA3的N端結構發(fā)生突變時，小鼠發(fā)生脫發(fā)、皮膚炎癥、皮膚角化病、畸形生長的風險上升[5,11]。②GSDMB的膜結合偏好與其他GSDM家族成員不同。GSDMB的全長和N端結構域均可與磷酸肌醇和糖脂類硫苷脂結合。與硫苷脂結合的能力表明GSDMB可能與細胞膜的外側脂質相互作用，這與其他GSDM家族成員不同[12]。③GSDMC被認為是一種轉錄因子，它不能通過炎癥或細胞凋亡相關的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, caspase)被激活。GSDMC 最初被命名為黑色素瘤衍生的亮氨酸拉鏈，因為在其羧基端(C-terminal，C端)結構域存在一個這樣的結構，這表明GSDMC可能識別細胞核中的特定DNA序列，并可能在細胞核和細胞質之間傳輸信號[8]。④GSDMF是一種與人類和小鼠聽力損傷相關的蛋白質。GSDMF的N端結構域2種錯義突變會使聽覺神經(jīng)元傳遞聽覺信號受損，導致耳聾[9]。⑤GSDMD具有誘導PCD和引發(fā)炎癥的能力，主要是在炎性小體信號傳導和焦亡中起作用。GSDMD是炎性小體相關caspase的底物，當GSDMD被caspase切割后，GSDMD的N端結構域活化，具有在宿主細胞膜上打孔的能力，既能使細胞內(nèi)外鈉-鉀離子濃度失去平衡，又能誘導細胞因子等釋放和引發(fā)PCD，并與炎性小體的激活相關[5,11]。⑥GSDME可通過caspase-3的切割，使其N端結構域活化，在細胞膜上打孔，誘導細胞焦亡，該結構域的過表達可導致293T細胞等產(chǎn)生細胞焦亡特征。有進一步的研究表明，轉染含有編碼人為截短的GSDME質粒會導致HEK293T細胞中活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平升高，引發(fā)細胞凋亡和壞死性細胞死亡[11]。因為GSDM家族在宿主與細菌的博弈中被兩者所影響，所以研究其在細菌感染中的作用機制和生物學意義能為細菌感染性疾病的新藥研發(fā)和臨床治療提供新的思路。

表1 GSDM家族成員分布

Tab.1 Distribution of GSDM family

Human GSDM familyExpressionMouse GSDM familyExpressionGSDMAEsophagus, lower gastrointestinal tract, mammary gland, skin, and stomachGSDMA1Skin and the squamous epithelium of the stomach cardiaGSDMA2SkinGSDMA3Epithelium of glandular stomachGSDMBBronchial epithelium of asthmatic lungs, the epithelium of esophagus and gastrointesti-nal tract Expression not reported or unknownExpression not reported or unknown GSDMCTrachea, epithelial cells of the stomach and esophagusGSDMC1-4Stomach, small intestine, cecum and colonGSDMDEsophagus, stomach and skinGSDMDEsophagus, stomach, skin, small intestine, cecum and colonGSDMEBrain, heart, kidney and placentaGSDMECochlea, thymus, colon, lung, brain, spleen and small intestineGSDMFHair cells, supporting cells of the central nervous system, spiral ganglion neurons, spiral ganglion cells of the inner ear and the cell bodies of neuronsGSDMFBrain, eye, ear, lung, heart, liver, kidney and small intestine

2.2 GSDM家族在PCD中的作用

除GSDMF以外，GSDM家族成員都具有保守的雙結構域序列：N端結構域和C端結構域。GSDM家族成員(除了GSDMF)被半胱天冬氨酸蛋白酶caspase切割后，均能使其N端活化，從而具有在細胞膜上打孔的能力，使細胞釋放白細胞介素(interleukin, IL)1β和IL-18，參與炎癥反應，在PCD中發(fā)揮重要作用[13]。該過程與下述有關：①細菌的侵入途徑、所攜帶的毒力基因種類及毒力基因編碼產(chǎn)物的作用方式；②機體的免疫系統(tǒng)狀況。以往認為在caspase家族中，caspase-2、3、6、7、8、9、10與細胞凋亡過程有關，caspase-1、4、5、11與炎癥反應有關[14]，然而新近研究顯示caspase家族在PCD中的作用可能并非如此[15-16,21]。

在PCD中，細胞凋亡是一種重要的細胞死亡類型。細胞凋亡是一種主動過程，它涉及一系列的基因激活、表達、調控等。細胞凋亡是多基因嚴格控制的過程，這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因c-myc、抑癌基因p53等。研究表明，切割GSDME的caspase-3在天然或非天然細胞凋亡中也發(fā)揮著不可替代的作用[17]，例如caspase-3能通過MAPK中的JNK子途徑發(fā)揮作用：在JNK雙磷酸化后激活JNK通路，促進轉錄因子復合物AP-1活性并伴隨多種凋亡蛋白產(chǎn)生，之后激活線粒體Bcl-2家族等，釋放細胞色素C，細胞色素C和caspase-9或凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)結合，作用于caspase-3，caspase-3與凋亡底物結合，引起細胞凋亡；并且在諸如此類的凋亡過程中，都能檢測到含量上升的活性化GSDME[15]。近期有報道顯示，caspase-1在GSDMD缺乏的細胞中，能引發(fā)細胞凋亡[16]。此外，GSDMA3在腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)所誘導的角化細胞中凋亡信號是必需的，GSDMA3通過直接增強caspase-3表達，導致了毛囊角化細胞凋亡[18]。

細胞焦亡是一種近年來發(fā)現(xiàn)的新的PCD，表現(xiàn)為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，導致細胞內(nèi)容物和大量與炎癥密切相關的促炎癥因子釋放，在抗感染中發(fā)揮重要作用。細胞焦亡的引發(fā)主要有2種途徑。①經(jīng)典途徑：在PAMP和損傷相關分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)的作用下，胞質內(nèi)感受器(NOD-like receptors，NLR)蛋白家族成員，如NLRP3(NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3)炎性小體[19]等會識別這些信號，通過銜接蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein with a caspase-recruitment domain)與caspase-1前體結合，激活caspase-1，caspase-1切割GSDMD，使其N端活性化而擁有在細胞質膜上打孔的能力，釋放細胞內(nèi)容物，從而激活細胞焦亡；同時活化的caspase-1對IL-1β和IL-18的前體進行切割，使IL-1β和IL-18活性化，其釋放至胞外后募集炎癥細胞聚集。②非經(jīng)典途徑：caspase 其他家族成員如caspase-4、5、11的前體在脂多糖等作用下被活化，活化的caspase-4、5、11切割GSDMD，誘導焦亡發(fā)生[20]；另一方面，促進caspase-1活化，對炎癥因子IL-1β和IL-18的前體進行切割，造成炎癥反應。除了GSDMD以外，GSDME也被證實能在caspase-3的特異性切割作用下，其N端活性化，引起細胞焦亡[21]。研究發(fā)現(xiàn)，不但在鼠髓源巨噬細胞和293T細胞這類能表達GSDME的細胞中發(fā)現(xiàn)了焦亡現(xiàn)象，而且像HeLa細胞這類不能表達GSDME的細胞，在經(jīng)過轉染一種編碼GSDME的質粒后，也能發(fā)現(xiàn)焦亡現(xiàn)象[22]。最近一項研究表明，腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)作為典型的激活因子誘導巨噬細胞內(nèi)NLRP3炎性小體活化，導致caspase-1/ GSDMD介導的焦亡，然而當NLRP3通路被感染性疾病阻斷時，ATP能通過caspase-3/GSDME誘導巨噬細胞焦亡[23](圖1)。研究發(fā)現(xiàn)，GSDMD和GSDME的N端不但能引發(fā)細胞焦亡，而且能使線粒體膜滲透化，釋放細胞色素C和caspase-3前體等與凋亡相關的因子，激活凋亡小體[24]。

圖1 GSDM家族成員經(jīng)caspase切割后的活性化

Fig.1 GSDM family are activated after caspase cleavage

GSDMA3能通過自我調節(jié)，控制自身組分缺失并靶向線粒體，引起細胞自噬。GSDMA3的N端具有促自噬活性，而其C端則具有抑制自噬活性的功能。GSDMA3突變體通過失去整個C端結構域來釋放N端結構域固有的促自噬活性，然后GSDMA3的N末端結構域與Hsp90/Hsp70復合物相關聯(lián)，通過線粒體導入受體Tom70傳遞給線粒體。在那里它與線粒體伴侶Trap1相互作用并誘導線粒體通透性轉換孔開放，生產(chǎn)線粒體ROS，釋放細胞色素C，最終導致細胞自噬[25]。

中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)的形成，可導致一種形式的細胞死亡，稱為NETosis[26]。這是一種新發(fā)現(xiàn)的PCD方式，近年來的一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了GSDMD介導的NETosis機制。GSDMD 的C端結構域(也稱為p20片段)與N端結構域(也稱為p30片段)之間的連接裂解后，釋放了N端結構域，該結構域寡聚形成細胞膜上的孔。這些小孔增加了細胞膜的通透性，促進NETs或炎癥細胞因子的釋放，從而引發(fā)炎癥反應的級聯(lián)反應[27]。

有研究表明，缺乏GSDMD/caspase-8的調控會促進細胞壞死性凋亡水平[28]。在293T等特殊細胞中，GSDME能在TNF等誘導下，經(jīng)caspase-3切割，使得細胞從凋亡狀態(tài)迅速轉向繼發(fā)性壞死/焦亡轉變[29]，暗示了GSDM家族參與的各種PCD之間可能存在某種聯(lián)系。GSDME還被猜測能在PCD早期通過促進細胞膜通透性，負調控凋亡細胞分裂成更小的膜結合小泡，有利于細胞內(nèi)促炎性物質的釋放[30]。

2.3 GSDM家族在細菌感染中的作用

近年來，有關GSDM家族成員在細菌入侵宿主并規(guī)避免疫防御機制的研究已為熱點，其在部分細菌中的作用已得到證實。

沙門菌(Salmonella)感染能夠引起宿主細胞焦亡。沙門菌感染巨噬細胞后，其鞭毛蛋白等能引發(fā)caspase-1切割GSDMD，使其N端活性化，從而在細胞膜上打孔，引發(fā)細胞焦亡[31]；沙門菌感染中性粒細胞時會引發(fā)非經(jīng)典炎癥信號通路，并引起依賴GSDMD的NETosis，而GSDMD將這兩種細胞死亡方式聯(lián)系起來[32]。人GBP1能夠在沙門菌感染時增強caspase-4的激活，并導致依賴GSDMD的細胞焦亡，促進抗細菌天然免疫[33]。沙門菌質粒毒力基因spv在沙門菌侵入宿主機體和規(guī)避宿主免疫防御的過程中起到了關鍵作用。本課題組近階段研究顯示，spv可影響宿主細胞GSDM活化, 進而干預細菌感染的進程。沙門菌spv包括調控基因spvR和4個結構基因spvA、spvB、spvC和spvD[34]。spvB編碼的效應蛋白SpvB具有 二磷酸腺苷-核糖基轉移酶活性，它能共價修飾G-肌動蛋白(G-actin)單體，從而抑制其聚合形成F-肌動蛋白(F-actin)，最終影響細胞骨架解聚[34]。本課題組前期研究證實SpvB還能通過抑制自噬體的形成，阻止宿主細胞通過自噬清除細菌[35]。spvC編碼的效應蛋白SpvC能通過抑制宿主體內(nèi)的MAPK信號途徑激活，從而降低促炎癥細胞因子和趨化因子的水平，抑制炎癥反應，促進沙門菌的全身播散[36]。spvD編碼的效應蛋白SpvD則具有caspase活性，通過抑制核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信號轉導通路從而抑制炎癥反應，促進沙門菌的全身播散[37]。

耶爾森菌(Yersinia)蛋白J(YopJ)是由耶爾森菌分泌到宿主細胞中的一種Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)效應蛋白，近年來YopJ被證實能夠通過抑制巨噬細胞等的MAPK通路和NF-κB通路等，調控細胞死亡。耶爾森菌能通過YopJ抑制TAK1來抑制TNF等細胞因子的表達，阻止IL-1前體的產(chǎn)生，并在TAK1抑制期間，通過caspase-8的激活，切割小鼠巨噬細胞中的GSDMD和GSDME，導致N端活化，在細胞膜上打孔及釋放內(nèi)容物，從而使細胞焦亡。耶爾森菌通過分泌YopJ，在抑制MAPK途徑和阻止IL-1前體釋放的同時，主動引發(fā)細胞焦亡，從而在殺死巨噬細胞的同時抑制炎癥反應，破壞宿主的免疫防御[38]。人類巨噬細胞具有抵抗YopJ介導的細胞焦亡的能力，因此與嚙齒類動物宿主相比，人類對耶爾森菌感染有更高的敏感性。

腸出血性大腸埃希菌(Enterohemorrhagicescherichiacoli，EHEC)分泌的志賀毒素2(Stx2)能激活人巨噬細胞THP-1中的caspase-4、GSDMD和NLRP3炎性小體，但不激活缺乏Stx受體CD77的小鼠巨噬細胞。Stx2介導的IL-1β分泌和細胞焦亡依賴于線粒體中富含的線粒體ROS以及GSDMD的裂解。抑制caspase-4激活，ROS生成及GSDMD缺陷會顯著減少Stx2介導的IL-1β生產(chǎn)和細胞焦亡。NLRP3炎性小體在Stx2誘導的GSDMD裂解中發(fā)揮重要作用，在NLRP3缺失的THP-1細胞中，這些反應顯著降低。Stx2會激活NLRP3炎性小體上游的非經(jīng)典炎性小體和線粒體ROS，促進細胞因子成熟和細胞吞噬。EHEC分泌的Stx2在其脂多糖的輔助作用下，促進IL-1β和TNF-α的生成，并誘導GSDMD介導的細胞焦亡，引發(fā)劇烈的炎癥反應，對機體造成嚴重損傷[39]。

新洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacenocepacia)[40]是一種革蘭陰性機會致病菌，可引起囊性纖維化病患者發(fā)生嚴重的慢性肺部感染。新洋蔥伯克霍爾德菌采用一種被命名為TecA的非VgrG的Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)，通過抑制Rho GTP酶活性，導致肌動蛋白細胞骨架的解聚，從而在巨噬細胞中存活。TecA和其他細菌同源物攜帶caspase樣催化三聯(lián)物，通過在GTP酶Ⅰ型開關區(qū)域使保守的天冬酰胺去酰胺化，從而導致Rho GTP酶失活。RhoA脫氨會誘導caspase-1活化，該活化由家族性地中海熱病蛋白Pyrin介導，并最終使GSDMD被切割后活性化，引發(fā)PCD，促進炎癥反應。新洋蔥伯克霍爾德菌通過分泌TecA主動介導PCD，引發(fā)炎癥使機體免受因細菌感染造成的致命損傷，從而與宿主達到共生或互利的狀態(tài)[41]。

新兇手弗朗西斯菌(Francisellanovicida)[42]能主動通過AIM2炎性小體活化GSDMD，引發(fā)細胞焦亡，抑制環(huán)GMP-AMP合酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)驅動Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，抵抗后者對其殺傷作用。有報道證實β干擾素(IFN-β)對新兇手弗朗西斯菌感染的反應在GSDMD缺陷小鼠中升高。AIM2炎性小體激活的GSDMD在介導細胞焦亡的同時，還能導致細胞內(nèi)外鉀離子濃度失衡，最終耗盡細胞內(nèi)鉀離子。這種鉀離子外排對抑制cGAS依賴的IFN-β產(chǎn)生是充分且必要的[43]。

除此之外，GSDM家族在金黃色葡萄球菌感染(Staphylococcusaureus)造成的骨損傷[44]以及在志賀菌(Shigella)和肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)等造成的細菌感染[45]引發(fā)的PCD中都起到了重要作用。

3 結語

研究表明，GSDM家族介導的宿主PCD在部分細菌入侵造成的感染中扮演了重要的角色。PCD是一種宿主機體在細菌入侵時重要的抵抗方式，它擁有提供抗原信息、圍困細胞內(nèi)細菌使之不能離開細胞殘體和淘汰寄生體等功能，因此細菌在感染機體時一般會避免PCD。然而，迄今為止已發(fā)現(xiàn)眾多病原體能在感染機體時主動引發(fā)PCD[38-39,41,43,46]。與上述PCD過程相關的GSDM家族則在細胞凋亡、細胞焦亡及繼發(fā)性壞死等方面起著無可替代的作用[31-46]。研究細菌感染與GSDM家族介導PCD之間的關系，能夠為此類疾病的臨床醫(yī)治、預防以及新藥研發(fā)提供新思路。