徐水寶，楊思宇，翁珊珊，陳晨，陳澍，張文宏，金嘉琳

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科， 上海 200040

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KP)是一種革蘭染色陰性、有莢膜的腸桿菌科細(xì)菌，廣泛存在于環(huán)境中，亦寄生于人類的皮膚、鼻咽部、腸道等，為條件致病菌，主要感染免疫功能低下者[1]。1986年7例由KP引起的肝膿腫并發(fā)眼內(nèi)炎首次被報(bào)道，并被定義為高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae，HVKP)[2]。HVKP也可引起健康人群肝膿腫伴遠(yuǎn)處播散，如眼內(nèi)炎、壞死性筋膜炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等，稱為侵襲綜合征[2-3]。此后，HVKP的報(bào)道在全球范圍逐漸增多，早診斷、早治療可改善其感染的預(yù)后，然而目前仍然缺乏確切的分子診斷標(biāo)準(zhǔn)和特異性分子標(biāo)志物(不同文獻(xiàn)之間所述標(biāo)準(zhǔn)不一)，對人類健康造成嚴(yán)重威脅。本研究對分離自本院的25株HVKP與28株普通肺炎克雷伯菌(classicKlebsiellapneumoniae，cKP)血清型和毒力基因分布特點(diǎn)進(jìn)行比較分析，探索HVKP的分子標(biāo)志物，期望對該病的分子診斷提供數(shù)據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 對象

從復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院(2009―2018年)住院患者中，根據(jù)臨床病史和病原學(xué)檢查結(jié)果，篩選出侵襲綜合征KP陽性患者(表1)，從本院保存的菌庫中獲得相應(yīng)的非重復(fù)KP菌株共25株，將其視為HVKP組；從菌庫中隨機(jī)抽取血流感染的KP菌株，并根據(jù)病史剔除有合并其他侵襲性感染的菌株，最終得到28株，將其視為cKP組。

本研究關(guān)于HVKP組和cKP組的劃分主要通過臨床定義。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，HVKP引起的侵襲綜合征主要表現(xiàn)為肝膿腫合并肝外侵襲性感染，如眼內(nèi)炎、壞死性筋膜炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等[3]。

血清型主要包括K1、K2、K5、K20、K54和K57[4-6]；毒力基因包括[6-9]：①莢膜多糖合成和合成調(diào)控相關(guān)基因[10-11]wcaG和rmpA、rmpA2、magA；②菌毛合成相關(guān)基因[12]fimH、mrkD；③脂多糖相關(guān)基因[13]uge、wabG；④鐵攝取系統(tǒng)相關(guān)基因[14]aero、iucB、iutA、iroNB、ybtA、kfuBC；⑤尿素酶相關(guān)基因[10]ureA、allS。

表1 25株HVKP菌株臨床特點(diǎn)

Tab.1 Clinical characteristics of 25 strains of HVKP

菌株編號菌株來源侵襲綜合征表現(xiàn)KP1血肝膿腫、化膿性腰椎間盤感染、菌血癥KP2血肝膿腫、眼內(nèi)炎、肺膿腫、菌血癥KP3血肝膿腫、肺膿腫、泌尿系感染、菌血癥KP4膿液肝膿腫、肺膿腫KP5血肝膿腫、皮膚軟組織感染、肺部感染、菌血癥KP6血肝膿腫、肺膿腫、菌血癥KP7膿液肝膿腫、肺膿腫KP8膿液肝膿腫、肺膿腫KP9膿液肝膿腫、腦膿腫、肺部感染KP10膿液肝膿腫、肛周膿腫KP11膿液肝膿腫、皮膚軟組織感染KP12血肝膿腫、腰大肌膿腫、菌血癥KP13血肝膿腫、眼內(nèi)炎、菌血癥KP14血肝膿腫、皮膚軟組織感染、菌血癥KP15血肝膿腫、眼內(nèi)炎、菌血癥KP16血肝膿腫、眼內(nèi)炎、肺部感染、菌血癥KP17膿液肝膿腫、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染KP18血肝膿腫、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、菌血癥KP19膿液肝膿腫、腦膿腫KP20血肝膿腫、眼內(nèi)炎、肺部感染、菌血癥KP21血肝膿腫、眼內(nèi)炎、菌血癥KP22血肝膿腫、肺膿腫、菌血癥KP23血肝膿腫、皮膚軟組織感染、肺部感染KP24血頸部蜂窩織炎、化膿性椎間盤感染、菌血癥KP25血皮膚軟組織感染、菌血癥

1.2 方法

菌株進(jìn)行復(fù)蘇和培養(yǎng)，采用Tiangen TIANamp Bacteria DNA Kit提取菌株DNA。血清型和毒力基因的引物序列參照文獻(xiàn)(表2、表3)， 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR體系20 μL: 1 μL DNA模板、0.5 μL引物R、0.5 μL引物F、10 μL Premix Taq (TaKaRa Premix Taq Version 2.0)、8 μL ddH2O。PCR條件：預(yù)變性95 ℃ 3 min；變性95 ℃ 30 s，退火(溫度見表2、3) 30 s，延伸 72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 維持 10 min。PCR產(chǎn)物在1%濃度瓊脂糖凝膠中電泳(電壓 120 V，時(shí)間 30 min)，經(jīng)紫外成像儀拍照保存。

表2 KP血清型PCR引物

Tab.2 Primers used for detecting KP serotypes by PCR

SerotypeSequence (5′-3′)bpAnnealing(℃)K1[10]K1-FGGTGCTCTTTACATCATTGC1 28358K1-RGCAATGGCCATTTGCGTTAGK2[10]K2-FGACCCGATATTCATACTTGACAGAG64158K2-RCCTGAAGTAAAATCGTAAATAGATGGCK5[10]K5-FTGGTAGTGATGCTCGCGA28058K5-RCCTGAACCCACCCCAATCK20[10]K20-FCGGTGCTACAGTGCATCATT74158K20-RGTTATACGATGCTCAGTCGCK54[10]K54-FCATTAGCTCAGTGGTTGGCT88158K54-RGCTTGACAAACACCATAGCAGK57[10]K57-FCCAGTAATCAGTCCAGAAACAACC103758K57-RTAGCTTTTTTCATTCTTGTGTTTGTT

表3 KP毒力基因PCR引物

Tab.3 Primers used for detecting KP virulence genes by PCR

Virulence genesSequence(5′-3′)bpAnnealing(℃)rmpA[15]rmpA-FACTGGGCTACCTCTGCTTC51658rmpA-RCTTGCATGAGCCATCTTTCArmpA2[15]rmpA2-FTGTGCAATAAGGATGTTACATTAGT53558rmpA2-RTTTGATGTGCACCATTTTTCAaero[15]aero-FGCATAGGCGGATACGAACAT55649aero-RCACAGGGCAATTGCTTACCTwcaG[16]wcaG-FGGTTGGKTCAGCAATCGTA16949wcaG-RACTATTCCGCCAACTTTTGCallS[16]allS-FCCGAAACATTACGCACCTTT50849allS-RATCACGAAGAGCCAGGTCACfimH[16]fimH-FTGCTGCTGGGCTGGTCGATG68849fimH-RGGGAGGGTGACGGTGACATCuge[16]uge-FTCTTCACGCCTTCCTTCACT54349uge-RGATCATCCGGTCTCCCTGTAwabG[16]wabG-FACCATCGGCCATTTGATAGA68349wabG-RCGGACTGGCAGATCCATATCureA[16]urea-FGCTGACTTAAGAGAACOTTATG33755urea-RGATCATGGCGCTACCTCAiutA[16]iutA-FGGCTGGACATCATGGGAACTGG30055iutA-RCGTCGGGAACGGGTAGAATCGiroNB[16]iroNB-FGGCTACTGATACTTGACTATTC99250iroNB-RCAGGATACAATAGCCCATAGybtA[16]ybtA-FATGACGGAGTCACCGCAAAC96055ybtA-RTTACATCACGCGTTTAAAGGkfuBC[16]kfuBC-FGAAGTGACGCTGTTTCTGGC79755kfuBC-RTTTCGTGTGGCCAGTGACTCmrkD[16]mrkD-FTTCTGCACAGCGGTCCC24049mrkD-RGATACCCGGCGTTTTCGTTAC

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分類變量用卡方檢驗(yàn)做比較。對2組之間有顯著差異的分子標(biāo)志物分別計(jì)算其靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度和約登指數(shù)。應(yīng)用二元Logistic回歸(向后：LR)對分子標(biāo)志物進(jìn)行多因素分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 HVKP組中最常見的血清型為K1型

HVKP組(25株)中最常見的血清型為K1型，占60% (15/25)；另外還檢測到K2和K20各2株，未測到血清型K5、K54和K57。HVKP組與cKP組相比，血清型K1有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=9.983，P<0.05)，K2和K20雖然在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無差異，但這2種血清型只在HVKP組中測到(表4)。

表4 HVKP與cKP血清型比較

Tab.4 Comparison of serotypes between HVKP and cKP

SerotypeHVKP (n=25)cKP(n=28)χ2PK115(60.00%)5(17.86%)9.9830.002K22(8.00%)0-0.218K500--K202(8.00%)0-0.218K5400--K5700--

2.2 毒力基因分布

HVKP組中毒力基因陽性率最高的前3種為uge、fimH和wabG，分別占100%、96% 和92%。與cKP組相比，毒力基因有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的是rmpA2 (χ2=6.335，P=0.012)、magA(χ2=9.983，P=0.002)、fimH(χ2=9.389，P=0.002)、aero(χ2=6.692，P=0.010)、iutA(χ2=23.645,P=0.000)、kfuBC(χ2=14.018，P=0.000)。其他基因雖然在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無差異，但在HVKP組中基因的陽性率基本都高于cKP組。如果增大樣本量，可能會得到不同的結(jié)果(表5)。

對HVKP與cKP組之間有顯著差異的分子標(biāo)志物，分別計(jì)算其靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度和約登指數(shù)。根據(jù)約登指數(shù)將標(biāo)志物的診斷效能由高到低排列：iutA>kfuBC>magA(K1)>aero>fimH>rmpA2。經(jīng)多因素Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)iutA在HVKP與cKP組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.002)，見表6、表7和圖1。

表5 HVKP和cKP毒力基因比較

Tab.5 Comparison of virulence genes between HVKP and cKP

Virulence genesHVKP(n=25)cKP (n=28)χ2PrmpA15(60.00%)13(46.43%)0.9760.323rmpA220(80.00%)13(46.43%)6.3350.012magA15(60.00%)5(17.86%)9.9830.002wcaG9(36.00%)7(25.00%)0.7580.384fimH24(96.00%)17(60.71%)9.3890.002mrkD18(72.00%)16(57.14%)1.2680.260uge25(100%)23(82.14%)3.0610.080wabG23(92.00%)23(82.14%)0.4250.515aero16(64.00%)8(28.57%)6.6910.010iutA18(72.00%)2(7.14%)23.6450.000iroNB4(16.00%)02.8240.093ybtA23(92.00%)21(75.00%)1.6360.201kfuBC20(80.00%)8(28.57%)14.0180.000ureA22(88.00%)26(92.86%)0.0180.894allS9(36.00%)6(21.43%)1.3820.240

圖1 HVKP分子標(biāo)志物約登指數(shù)

Fig.1 Yoden index of molecular markers in HVKP

表6 HVKP分子標(biāo)志物準(zhǔn)確度、靈敏度、特異度和OR值

Tab.6 Accuracy, sensitivity, specificity andORvalue of molecular markers in HVKP

Molecular markersAccuracy(%)Sensitivity(%)Specificity(%)Yoden indexOR(95% CI)K171.760.082.10.4216.900(1.967,24.209)rmpA266.080.053.60.3364.615(1.350,15.784)magA71.760.082.10.4216.900(1.967,24.209)fimH66.096.039.30.35315.529(1.828,131.902)aero67.964.071.40.3544.444(1.397,14.138)iutA52.872.092.90.64933.429(6.215,179.805)kfuBC75.580.071.40.51410.000(2.787,35.885)

表7 HVKP分子標(biāo)志物多因素Logistic回歸分析

Tab.7 Multivariate logistic regression of molecular markers in HVKP

Molecular markersBS.E.WalsPExp(B)95% CIK11.0451.1150.8790.3492.8440.320,25.282rmpA2-1.5691.1441.8820.1700.2080.022,1.960aero-1.5821.2481.6090.2050.2050.018,2.370fimH2.0671.2722.6440.1047.9000.654,95.439iutA4.3771.4329.3400.00279.6234.807,1 318.947kfuBC0.4731.0750.1940.6601.6050.195,13.192

3 討論

目前，關(guān)于HVKP的分子標(biāo)志物相關(guān)報(bào)道不多。本研究將侵襲綜合征患者中分離的菌株視為HVKP，單純血流感染患者中分離的菌株視為cKP，通過對既往所報(bào)道的KP血清型和毒力基因分別在HVKP組和cKP組中進(jìn)行檢測和比較，篩選HVKP的分子標(biāo)志物，并評估其效能。

莢膜多糖是KP重要的毒力因子，主要通過抗巨噬細(xì)胞吞噬作用、抑制早期炎癥反應(yīng)、抵抗抗菌肽和抑制樹突細(xì)胞成熟幫助細(xì)菌免疫逃逸[6]。在目前發(fā)現(xiàn)的82種莢膜血清型中HVKP主要為K1、K2、K5、K20、K54和K57型[6-7, 16]。其中K1和K2型在亞洲地區(qū)常見[5-6]，血清型K1是亞洲地區(qū)最常見的血清型(21.7%)，在北美、歐洲和澳大利亞不常見[16]。研究表明K1型與侵襲綜合征密切相關(guān)，K2型菌株毒力一般低于K1型。本研究中HVKP組K1型占60.00%，cKP組K1型占17.86%,兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=9.983，P=0.002)。除此之外，HVKP組中還檢測到K2和K20型各2株，雖然與cKP組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與樣本量較小有關(guān)。本研究和既往研究結(jié)果較相符，均表明K1型是HVKP最常見的血清型。

莢膜多糖K1型主要的調(diào)控基因是magA[17]。研究發(fā)現(xiàn)magA只存在于K1型KP菌株中，而K1型被認(rèn)為是HVKP的主要血清型[18]。magA與高黏力表型密切相關(guān)，且該基因陽性的菌株往往在小鼠實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較高的毒力[19]。rmpA、rmpA2 是莢膜多糖合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因，可調(diào)控多種血清型合成，形成高黏力表型[6, 20]。一般認(rèn)為K1、K2型KP菌株高黏力表型多見，其莢膜多糖合成調(diào)控基因rmpA和rmpA2陽性率也往往較高[5]。

本研究中HVKP組magA和rmpA2基因分別占60.00%和80.00%,與cKP組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可作為HVKP的重要分子標(biāo)志物,與其他研究結(jié)果一致[5]。然而，rmpA在HVKP組陽性率為60.00%，在cKP組陽性率為46.43%,雖然HVKP組陽性率高于cKP組，但是在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無差異，與大部分文獻(xiàn)報(bào)道不符。這可能是因?yàn)闃颖玖刻?，若能增大樣本量，其更有說服力。但也有一些研究報(bào)道，部分菌株rmpA、rmpA2均陽性卻沒有高黏力表現(xiàn)，而且為低毒力，可能與基因突變有關(guān)。

菌毛有助于細(xì)菌定植，形成生物膜，T1P和T3P是KP的主要菌毛[6]。T1P由FimA和FimH組成，可介導(dǎo)細(xì)菌與宿主細(xì)胞上含甘露糖的受體結(jié)合，使細(xì)菌定植于泌尿生殖道、呼吸道、腸道等[6, 21]。T3P由MrkA和MrkD組成，主要黏附于內(nèi)皮細(xì)胞、呼吸道和尿路的上皮細(xì)胞[6]。本研究中，fimH在HVKP組中陽性率為96.00%, 在cKP組中陽性率為60.71%,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=9.389，P=0.002)；而mrkD在HVKP組中陽性率為72.00%,在cKP組中陽性率為57.14%,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=1.268，P=0.260)。雖然兩者在HVKP和cKP組中陽性率均不低，但是fimH比mrkD的特異性更強(qiáng)，故fimH提示為HVKP的可能性更大。

鐵對于細(xì)菌新陳代謝至關(guān)重要，鐵攝取系統(tǒng)是細(xì)菌重要的毒力分子機(jī)制。研究表明kfuBC編碼鐵攝取系統(tǒng)，是KP重要的毒力因子[9, 20]，在K1、K2血清型的HVKP中多見[22]。本研究中kfuBC在HVKP組中陽性率為80.00%,在cKP組中占28.57%,兩者差異較大(χ2=14.018,P=0.000)，kfuBC可成為HVKP的分子標(biāo)志物。

KP有4種鐵載體——enterbactin、aerobactin、yersiniabactin和salmochelin，其中enterbactin和aerobactin最為常見。有研究認(rèn)為aerobactin是KP重要的毒力因子，可使毒力增加100倍[6]，是HVKP常見的鐵載體。它由aero編碼合成，而iutA則編碼aerobactin的轉(zhuǎn)運(yùn)體，轉(zhuǎn)運(yùn)螯合體進(jìn)入細(xì)胞[23-24]。本研究中aero在HVKP組中陽性率為64.00%,在cKP組中陽性率為28. 57%,兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=6.691，P=0.010)，提示aero可作為HVKP分子標(biāo)志物，與既往文獻(xiàn)報(bào)道相符。王等研究發(fā)現(xiàn)引起肝膿腫的毒力較高的KP菌株中aero陽性率超過90%[1]。小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低毒力、鐵載體陰性的KP菌株經(jīng)基因編輯插入aero后毒力明顯增強(qiáng)，而敲除aero的KP突變體毒力和侵襲性明顯下降。這些研究都提示aero對KP毒力十分重要，aero陽性可在很大程度上提示高毒力[1, 25]。 本研究中iutA基因在HVKP組中占72.00%,而在cKP組中僅占7.14%,同樣差異明顯(χ2=23.645,P=0.000),說明iutA可作為HVKP的分子標(biāo)志物。

鐵載體中yersiniabactin在HVKP中可高達(dá)90%，其轉(zhuǎn)運(yùn)體主要由ybtA編碼；enterbactin經(jīng)c-葡萄糖基修飾后成為salmochelin，而iroNB是它的修飾基因。在本研究中yersiniabactin相關(guān)的ybtA基因在HVKP組的陽性率(92.00%)高于在cKP組的陽性率(75.00%)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；enterbactin相關(guān)的iroNB基因在HVKP組的陽性率為16.00%,而在cKP中未檢測到，可能該毒力基因與HVKP的高毒力有關(guān)，但由于樣本量較小，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無差異。所以，本研究中暫認(rèn)為ybtA和iroNB基因不適合作為HVKP的分子標(biāo)志物。

毒力基因wcaG與莢膜多糖合成相關(guān)，編碼合成細(xì)菌莢膜中巖藻糖成分，有助于逃逸巨噬細(xì)胞的吞噬作用[10]。但本研究中wcaG基因在2組的陽性率均不高，在HVKP組占36.00%,在cKP組占25.00%，故認(rèn)為wcaG可能不適合作為HVKP的分子標(biāo)志物。

脂多糖由O抗原、核心多糖和脂質(zhì)組成，是KP重要的毒力因素[6]。wabG是脂多糖核心多糖的合成酶基因之一，uge是UDP-半乳糖醛酸酯異構(gòu)酶編碼基因，與脂多糖合成相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，wabG在HVKP組中占92.00%,在cKP組中占82.14%,uge在HVKP組中陽性率為100%，在cKP組中為82.14%,兩者陽性率均較高，且無明顯差異，不適合作為HVKP的特異性分子標(biāo)志物。

尿素酶催化尿素分解為氨和二氧化碳，為細(xì)菌生長提供氮源[6]?；虼豼reABCDEFG編碼尿素酶，其中ureA、ureB和ureC是其主要的結(jié)構(gòu)亞基[26]。allS編碼尿囊素調(diào)節(jié)子激活劑，同時(shí)也與鐵載體aerobactin生成相關(guān)[10, 26]。本研究中ureA陽性率在HVKP組(88.00%)和cKP組(92.86%)差異不大(χ2=0.018,P=0.894)；基因allS的陽性率不高，在HVKP組(36.00%)中陽性率高于cKP組(21.43%)，但是無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=1.382,P=0.240)。ureA和allS基因不適合作為HVKP的分子標(biāo)志物。

本研究存在的一些不足之處：①樣本量較小，若擴(kuò)大樣本量，結(jié)論可能會發(fā)生改變。比如部分試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明一些毒力基因和血清型陽性率在HVKP組中高于cKP組，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異，若能增大樣本量，可能會得到不同的結(jié)果。②HVKP為臨床定義，即為引起侵襲綜合征的KP菌株，未通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對其高毒力進(jìn)行驗(yàn)證，研究缺乏足夠的嚴(yán)謹(jǐn)性。 ③雖然本文在選擇cKP菌株時(shí)對臨床病例資料進(jìn)行了篩選，只選擇單純血流感染的病例，剔除合并其他部位侵襲性感染的病例，減少了混入HVKP組的風(fēng)險(xiǎn)，但并不能完全將其籠統(tǒng)地歸為cKP組。