錢雷，于建秀，尚守亮，于廣亞

(1. 濱海縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，2. 濱?？h中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 鹽城 224500)

近年來(lái)，包括中國(guó)在內(nèi)的發(fā)展中國(guó)家和發(fā)達(dá)國(guó)家青少年肥胖的患病率均大幅上升，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降、社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)加重[1]。青少年肥胖易伴發(fā)脂質(zhì)水平異常，與成年后心血管疾病、2型糖尿病、高血壓、血脂異常和癌癥密切相關(guān)[2]。脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp-PLA2)是一種新型心血管炎癥損傷的生物標(biāo)志物，參與動(dòng)脈粥樣硬化的病理生理過(guò)程。Lp-PLA2可水解低密度脂蛋白(LDL)上的氧化磷脂，生成氧化游離脂肪酸和溶血卵磷脂，引起內(nèi)皮功能障礙，參與血管炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展，在成人動(dòng)脈粥樣硬化患者外周血中其含量顯著升高[3]。但肥胖青少年外周血Lp-PLA2水平的變化研究較少，本研究通過(guò)檢測(cè)肥胖青少年外周血Lp-PLA2水平，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察脂肪細(xì)胞產(chǎn)生Lp-PLA2的功能，探討肥胖對(duì)青少年外周血Lp-PLA2水平的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本次橫斷面研究選擇2018年2月至10月在濱?？h人民醫(yī)院體檢的肥胖青少年36例，同時(shí)選取年齡、性別相匹配的正常體重青少年36例作為對(duì)照組，兩組一般資料具有可比性(表1)。納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)中國(guó)學(xué)齡兒童青少年超重、肥胖篩查體重指數(shù)值分類標(biāo)準(zhǔn)[4]，篩選年齡12～18歲的肥胖青少年。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴自身免疫性疾病、感染性疾病、血液病、惡性腫瘤、肝腎功能不全患者；近期有創(chuàng)傷、手術(shù)史，使用抗生素、降脂藥物。本研究得到濱海縣人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有青少年的父母都簽署了知情同意書。

表1 研究對(duì)象臨床資料

1.2 方法

1.2.1 臨床生化指標(biāo)檢測(cè) 采集受試者清晨空腹靜脈血4 mL，經(jīng)1000×g離心10 min，收集血清。采用貝克曼AU5800全自動(dòng)生化分析儀及其配套試劑檢測(cè)血清總膽固醇、三酰甘油、HDL-C、LDL-C、載脂蛋白A1和載脂蛋白B。采用熒光素增強(qiáng)免疫化學(xué)發(fā)光法(南京諾爾曼公司)檢測(cè)血清Lp-PLA2濃度。用測(cè)距儀和數(shù)字秤分別檢測(cè)青少年身高和體重，計(jì)算BMI，BMI=體重(kg)/身高(m)平方。

1.2.2 脂肪細(xì)胞培養(yǎng) 將人前脂肪細(xì)胞(上海聯(lián)邁生物公司)置于含有10%胎牛血清和青霉素的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2中培養(yǎng)48 h，然后用經(jīng)典的雞尾酒誘導(dǎo)培養(yǎng)基(0.5 mmol/L 1-甲基3-異丁基黃嘌呤，1 μmol/L地塞米松和10 μg/mL胰島素)培養(yǎng)48 h，誘導(dǎo)細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。將培養(yǎng)基更換為含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，分為L(zhǎng)DL-C(67 pmol/L)刺激組、LDL-C+Lp-PLA2抑制劑達(dá)普拉締(Darapladib，20 μmol/L, 美國(guó)Cayman公司)組，培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞和上清液，分別檢測(cè)Lp-PLA2 mRNA和Lp-PLA2、oxLDL濃度；培養(yǎng)72 h收集上清液，檢測(cè)oxLDL濃度。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)6孔。上清液oxLDL和Lp-PLA2濃度檢測(cè)分別采用ELISA方法(美國(guó)Elabscience公司)和熒光素增強(qiáng)免疫化學(xué)發(fā)光法(南京諾爾曼公司)，重復(fù)3次取均值，oxLDL檢測(cè)下限18.75 pg/mL。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)脂肪細(xì)胞Lp-PLA2 mRNA表達(dá) 收集經(jīng)LDL-C刺激48 h后脂肪細(xì)胞，使用Trizol試劑分離總RNA。用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑合成cDNA，并使用SYBR green PCR試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)擴(kuò)增分析樣品。引物由上海生工公司合成，Lp-PLA2引物序列：上游5′-TAATGATCGCCTTGACACCCT-3′和下游5′-TACAGCAGCAACTATAAACCC-3′。GAPDH基因引物序列：上游5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′和下游5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。熱循環(huán)條件如下：95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，35個(gè)循環(huán)，60 ℃ 1 min。GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，通過(guò)2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算每個(gè)樣本Lp-PLA2 mRNA表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組青少年外周血Lp-PLA2濃度比較

與正常體重組外周血Lp-PLA2濃度[(123.5±27.3)ng/mL]相比，肥胖組外周血Lp-PLA2濃度[(353.4±30.4)ng/mL]顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=33.76,P<0.01)。

2.2 肥胖青少年外周血Lp-PLA2濃度與BMI和腰圍的相關(guān)性分析

肥胖青少年外周血Lp-PLA2濃度與BMI(r=0.414,P=0.012)，腰圍(r=0.460,P=0.004)呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.3 肥胖青少年外周血Lp-PLA2濃度與血脂單變量回歸模型分析

以肥胖青少年外周血Lp-PLA2濃度為因變量，總膽固醇、LDL-C、HDL-C、三酰甘油、載脂蛋白A1及載脂蛋白B為協(xié)變量，采用前進(jìn)法分析顯示，肥胖青少年血清Lp-PLA2水平與總膽固醇、LDL-C、載脂蛋白A1及載脂蛋白B有關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

圖1 肥胖青少年血清Lp-PLA2濃度與BMI、腰圍的相關(guān)性

表2 Lp-PLA2與血脂的單變量回歸模型分析

2.4 LDL-C調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞Lp-PLA2表達(dá)

LDL-C與脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)上清液Lp-PLA2濃度較對(duì)照組顯著升高，脂肪細(xì)胞Lp-PLA2 mRNA表達(dá)也顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 LDL-C調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞Lp-PLA2表達(dá) n=6

2.5 Lp-PLA2抑制劑調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞oxLDL合成

與LDL-C刺激組相比，LDL-C+Lp-PLA2抑制劑組培養(yǎng)上清液oxLDL濃度顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 Lp-PLA2抑制劑調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞oxLDL合成 ng/mL，n=6

3 討論

肥胖由世界衛(wèi)生組織定義為對(duì)健康構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)的異?；蜻^(guò)度脂肪堆積，是一種具有潛在破壞性后果的全球性疾病。超重或肥胖的青少年成年后肥胖的風(fēng)險(xiǎn)增加約5倍，與肥胖相關(guān)合并癥的風(fēng)險(xiǎn)很高[5]。青少年肥胖的持續(xù)存在與成年后動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病、糖尿病和死亡風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)[6]。與肥胖相關(guān)的高血壓、糖尿病、血脂異常和睡眠呼吸暫停綜合征也被證明增加心血管疾病的發(fā)病率[7]。肥胖人群易發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制是脂質(zhì)、氧化的LDL顆粒和游離脂肪酸可激活炎癥過(guò)程，引起內(nèi)皮功能障礙、高凝狀態(tài)和全身性炎癥，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。

Lp-PLA2是相對(duì)分子質(zhì)量為50 kDa的鈣依賴性絲氨酸脂肪酶，大約80%的循環(huán)Lp-PLA2與LDL顆粒結(jié)合，水解LDL上的氧化卵磷脂，促進(jìn)血管壁中oxLDL的形成，生成氧化游離脂肪酸和溶血卵磷脂，引起血管炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展[8]。近年來(lái)研究表明Lp-PLA2是成人心血管風(fēng)險(xiǎn)的良好生物標(biāo)志物[9]。Acevedo等[10]研究發(fā)現(xiàn)，代謝綜合征患者有慢性低度炎癥，并且有更高的Lp-PLA2活性。通過(guò)減肥手術(shù)可降低肥胖患者oxLDL和Lp-PLA2濃度，增加抗動(dòng)脈粥樣硬化的血漿HDL形成[11]。本組病例證實(shí)，肥胖青少年外周血Lp-PLA2顯著升高，表明肥胖青少年存在心血管疾病發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)。

研究證實(shí)兒童肥胖與動(dòng)脈粥樣硬化的指標(biāo)-頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度(CIMT)、動(dòng)脈硬化和成人期冠狀動(dòng)脈鈣化密切相關(guān)[12]。本組資料中，肥胖青少年Lp-PLA2濃度與BMI呈正相關(guān)。但BMI沒(méi)有提供脂肪分布的信息，用于測(cè)量肥胖程度有一定的局限性。腰圍是腹部肥胖的簡(jiǎn)單且可靠的指標(biāo)，男性超過(guò)102 cm、女性超過(guò)88 cm的人群心血管風(fēng)險(xiǎn)增加[13]。Taylor等[14]證實(shí)男性青少年腰圍升高與心臟代謝疾病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，腰圍升高的超重女性易引起血壓升高。本組資料也顯示肥胖青少年Lp-PLA2濃度與腰圍呈正相關(guān)，表明身體脂肪分布與Lp-PLA2密切相關(guān)。

本次研究還表明，肥胖青少年外周血LDL-C、載脂蛋白B等血脂參數(shù)是Lp-PLA2濃度升高的影響因素。研究表明成人Lp-PLA2與載脂蛋白B/載脂蛋白A1比例、LDL-C和C-反應(yīng)蛋白等心血管風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物呈正相關(guān)，與HDL-C和載脂蛋白A1呈負(fù)相關(guān)[15]。Hatoum等[16]研究50～60歲的老年患者，觀察到Lp-PLA2與總膽固醇、LDL-C、載脂蛋白B和BMI呈正相關(guān)。Okada等[17]研究表明肥胖兒童外周血Lp-PLA2水平與體重、腰圍/身高比和LDL-C水平呈正相關(guān)。Motykova等[18]檢查一組非糖尿病肥胖或超重兒童，證實(shí)體重減輕可降低Lp-PLA2水平。上述研究均表明，在各年齡階段，LDL-C、載脂蛋白B是導(dǎo)致Lp-PLA2增加的重要參數(shù)。

肥胖人群體內(nèi)脂肪細(xì)胞和脂肪組織過(guò)度堆積，脂肪細(xì)胞能夠攝入LDL-C，釋放脂肪酸、膽固醇和Lp-PLA2[19]。為了進(jìn)一步闡明脂肪細(xì)胞內(nèi)LDL-C與Lp-PLA2之間的內(nèi)在聯(lián)系，我們通過(guò)體外培養(yǎng)脂肪細(xì)胞，結(jié)果顯示LDL-C刺激脂肪細(xì)胞合成Lp-PLA2。Lp-PLA2抑制劑可抑制脂肪細(xì)胞代謝LDL-C，導(dǎo)致oxLDL合成減少。結(jié)果說(shuō)明通過(guò)抑制脂肪細(xì)胞Lp-PLA2降低oxLDL的產(chǎn)生可能是預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的靶點(diǎn)。

綜上所述，肥胖青少年BMI、腰圍、總膽固醇、LDL-C、載脂蛋白A1及載脂蛋白B與外周血Lp-PLA2升高有關(guān)。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，LDL-C可促進(jìn)脂肪細(xì)胞分泌Lp-PLA2，通過(guò)抑制Lp-PLA2可顯著降低脂肪細(xì)胞產(chǎn)生oxLDL。因此，肥胖青少年應(yīng)盡早通過(guò)飲食和生活方式的干預(yù)減輕體重，降低脂質(zhì)水平，控制Lp-PLA2升高，預(yù)防心血病疾病的發(fā)生。