劉嫣方，付敏，劉海冰，尹亮，王冬青

(1. 江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 鎮(zhèn)江 212002； 2. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 3. 江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002； 4. 江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院普外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002； 5. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院影像科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

利用效應(yīng)T細(xì)胞殺滅腫瘤細(xì)胞的免疫療法，尤其是針對(duì)免疫檢查點(diǎn)例如程序性死亡蛋白1和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-4的抑制在黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌等腫瘤的治療中獲得了較好的臨床效果[1-2]。但是，臨床研究表明，現(xiàn)有的免疫檢查點(diǎn)治療并沒有抑制胰腺癌的進(jìn)展或延長患者的總體生存率，其中重要原因就是胰腺癌具有高度免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境[3]。免疫細(xì)胞及炎癥因子是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，在腫瘤相關(guān)免疫應(yīng)答中起重要作用。CD4+輔助性T細(xì)胞(Th)是腫瘤免疫應(yīng)答的核心成員，目前CD4+T細(xì)胞亞群在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的生物學(xué)作用尚不完全清楚。因此，本研究擬通過檢測(cè)胰腺癌患者外周血中Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子水平，探討CD4+T細(xì)胞亞群在胰腺癌腫瘤免疫中的作用及其臨床意義。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年5月至2019年7月于鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院普外科及腫瘤科就診的胰腺癌患者27例作為胰腺癌組，其中男15例，女12例，年齡39～80歲，平均(57.86±10.48)歲；胰頭癌18例，胰體尾癌9例。按照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期5例、Ⅱ期7例、Ⅲ期3例和Ⅳ期12例。所有患者術(shù)前未接受放療化療及免疫學(xué)治療，排除自身免疫性及感染性疾病，術(shù)后病理學(xué)證實(shí)為胰腺癌。另外選取同期30例健康體檢者作為對(duì)照組，其中男17例，女13例，年齡26～84歲，平均(52.35±11.21)歲。對(duì)照組與胰腺癌組年齡與性別無差異，具有可比性。

本研究方案獲鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.2 外周血血清及單個(gè)核細(xì)胞分離

清晨采集受試者空腹肘靜脈血2 mL于無菌真空干燥管中，靜置待血液凝固，2 500 r/min離心5 min，小心吸取血清，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

另采集肘靜脈血2 mL于EDTA抗凝管中，搖勻；取3 mL淋巴細(xì)胞分離液，沿管壁緩緩加入血液樣本，使血液置于分離液液面上；水平離心機(jī)2 000 r/min離心20 min；小心吸取分離液層及淋巴細(xì)胞層于另一新離心管，PBS洗滌2次；于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ELISA法檢測(cè)血清中細(xì)胞因子含量

用ELISA法檢測(cè)IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、TGF-β含量。所有試劑盒均為美國R&D Systems公司產(chǎn)品。操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，酶標(biāo)儀450 nm測(cè)光密度值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本含量。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達(dá)

取出凍存的外周血單個(gè)核細(xì)胞，加入1 mL Tri-zol裂解，提取細(xì)胞總RNA。利用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成模板cDNA，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行；合成的cDNA即刻行PCR或保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

定量PCR(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司7300擴(kuò)增儀)體系共20 μL：SYBR premix exTaq10 μL、上游引物(10 μmol/L)0.8 μL、下游引物(10 μmol/L)0.8 μL、ROX reference Dye(50×) 0.4 μL、cDNA 2 μL、雙蒸水6 μL。以β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)水平。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，80 ℃熒光收集30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1 各轉(zhuǎn)錄因子引物序列

2 結(jié)果

2.1 兩組Th1類及Th2類細(xì)胞因子與轉(zhuǎn)錄因子水平比較

與對(duì)照組相比，胰腺癌組Th1類細(xì)胞因子IL-2(t=4.889，P<0.01)及IFN-γ含量(t=0.265，P<0.05)明顯降低，轉(zhuǎn)錄因子T-bet mRNA表達(dá)明顯降低(t=2.400，P<0.05)；Th2類細(xì)胞因子IL-4含量明顯升高(t=3.505，P<0.01)，轉(zhuǎn)錄因子Gata-3 mRNA表達(dá)明顯升高(t=2.672，P<0.05)。見圖1。

圖1 胰腺癌組與對(duì)照組血清Th1類及Th2類細(xì)胞因子與轉(zhuǎn)錄因子水平比較

2.2 兩組Th17類及Treg類細(xì)胞因子與轉(zhuǎn)錄因子水平比較

與對(duì)照組相比，胰腺癌組Th17類細(xì)胞因子IL-17含量明顯升高(t=2.798，P<0.05)，轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA表達(dá)明顯升高(t=2.494，P<0.05)；Treg類細(xì)胞因子TGF-β(t=3.317，P<0.01)及IL-10(t=2.754，P<0.05)含量明顯升高，轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA表達(dá)明顯升高(t=4.119，P<0.01)。見圖2。

圖2 胰腺癌組與對(duì)照組Th17類及Treg類細(xì)胞因子與轉(zhuǎn)錄因子水平比較

3 討論

腫瘤免疫治療的效果與腫瘤組織內(nèi)免疫細(xì)胞的數(shù)量、種類及其分泌的炎癥因子密切相關(guān)。已證實(shí)胰腺癌組織中存在Th1和Th2兩種亞型的T細(xì)胞，且Th1/Th2的比例與胰腺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)[4]。Th2細(xì)胞比例較高的胰腺癌組織纖維成分豐富，M2型巨噬細(xì)胞增多，腫瘤進(jìn)展較快，對(duì)放療、化療及免疫治療敏感性較差[5-6]。本研究中胰腺癌患者外周血中Th1類細(xì)胞因子含量下降，而Th2類細(xì)胞因子IL-4含量明顯升高，證實(shí)胰腺癌中Th1和Th2細(xì)胞因子的平衡發(fā)生改變，Th2類細(xì)胞因子優(yōu)勢(shì)表達(dá)，發(fā)生Th1/Th2偏移。T-bet和Gata-3是參與調(diào)控Th1和Th2亞群分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，本研究結(jié)果顯示胰腺癌患者外周血中T-bet mRNA表達(dá)降低，Gata-3 mRNA表達(dá)明顯升高，但Th1/Th2偏移是否由于其抑制Th1分化或促進(jìn)Th2分化導(dǎo)致還需進(jìn)一步研究。

作為CD4+T細(xì)胞的第三類亞群細(xì)胞，Th17在胰腺癌惡性生物學(xué)行為中的作用仍存在爭(zhēng)議。研究表明，Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生發(fā)展并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞化[7-9]；也有研究發(fā)現(xiàn)，IL-17可通過募集髓源抑制細(xì)胞來抑制胰腺癌的免疫應(yīng)答[10]。本研究結(jié)果表明，胰腺癌患者外周血IL-17含量明顯增加，提示IL-17在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，拮抗IL-17是否可治療胰腺癌還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。RORγt是Th17細(xì)胞誘導(dǎo)分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，其低表達(dá)可限制Th17細(xì)胞分化，過表達(dá)則會(huì)在缺少Th17極化因子的條件下依然誘導(dǎo)IL-17的表達(dá)[11]。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌患者外周血中RORγt mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，提示胰腺癌可能有助于CD4+細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化。

作為腫瘤微環(huán)境中最主要的免疫抑制性細(xì)胞，CD4+CD25+Foxp3+Treg在實(shí)體瘤中的生物學(xué)效應(yīng)已越來越明確[12-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，胰腺癌組外周血TGF-β和IL-10水平明顯升高，轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)增加，提示Treg細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子可能與胰腺癌的發(fā)生及免疫逃逸密切相關(guān)。

綜上所述，胰腺癌患者Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答下降，Th2、Th17和Tregs類細(xì)胞因子優(yōu)勢(shì)表達(dá)，提示Th2、Th17和Tregs細(xì)胞可能協(xié)同加速胰腺腫瘤疾病的發(fā)展。有效重塑胰腺癌組織中Th1、Th2、Th17和Tregs的比例及其功能，對(duì)于改善胰腺癌免疫治療效果具有重要的意義。