朱津，張海，徐三榮

(江蘇大學附屬醫(yī)院普外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

肝細胞肝癌是肝臟原發(fā)性惡性腫瘤中最為常見的一種類型，具有發(fā)展隱匿、進展迅速、復發(fā)容易、預后不佳等特點，患者確診時多為晚期[1]。目前，針對肝癌的治療方法仍然以外科手術進行局限性切除為主，但由于肝癌的特殊性，往往只有部分患者符合肝臟腫瘤手術切除指征，因此，化療成為治療肝癌的重要手段[2]。多柔比星是臨床上常用的高效性廣譜化療藥物之一，長期使用易使腫瘤細胞產生明顯的耐藥性，致化療效果降低，嚴重影響肝癌患者的生存和預后[3]。COTE1基因，即人FAM189B基因(family with sequence similarity 189 member B)，廣泛表達于心臟、肝臟、肺等多個臟器[4]。有研究表明，COTE1能通過與WWOX(WW domain-containing oxidoreductase)相結合參與肝癌細胞的凋亡過程，影響肝癌細胞的增殖與轉移[5-6]，而WWOX又能夠通過凋亡途徑來逆轉肺癌、骨肉瘤等細胞的耐藥，提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[7-8]。但是，COTE1在腫瘤細胞耐藥中的作用尚不清楚，因此，本研究擬探討COTE1對肺癌細胞凋亡水平的影響，揭示COTE1在肝癌細胞耐藥中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

人肝癌PLC/PRF/5細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院；COTE1短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)慢病毒表達載體購自蘇州吉瑪基因有限公司；MEM(美國Hyclone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；多柔比星(大連美倫生物技術有限公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學公司)；RIPA裂解液、cocktail蛋白酶抑制劑(美國Sigma公司)；羊抗人COTE1抗體(美國Santa Cruz公司)；GAPDH抗體、β-肌動蛋白、驢抗羊二抗、兔抗小鼠二抗、嘌呤霉素、ECL試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物公司)；Annexin V-Alexa647 fluor/PI凋亡試劑盒(南京福麥斯生物公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞株PLC/PRF/5培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的MEM中，置于37 ℃、5%CO2恒溫孵育箱內，取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 慢病毒轉染及穩(wěn)轉細胞株的構建

將PLC/PRF/5肝癌細胞分為shRNA組和對照組，分別接種于6孔板；次日細胞匯合度達30%～50%時，shRNA組加入(1～2)×106/U慢病毒和2 μL多聚賴氨酸，使終濃度為5 μg/mL；24 h后換液；48 h后于熒光顯微鏡下觀察感染效率；加入0.1 μg/mL嘌呤霉素進行細胞篩選。對照組加入相同濃度的無關序列慢病毒，其余處理同shRNA組。shRNA組慢病毒靶序列：5′-GTATGTAAGCCTTCAATAA-3′，對照組慢病毒靶序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

1.4 實時熒光定量PCR檢測COTE1 mRNA表達

收集相應處理后的細胞，按照說明書提取各組細胞總RNA，再經過反轉錄合成cDNA模板，最后進行熒光定量PCR檢測。擴增條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s收集熒光。引物序列：COTE1上游引物 5′-GGGCTCTGACCTAGGCTTCT-3′、下游引物5′-ACAGAAGCTCTCCCAGTCCA-3′；β-肌動蛋白上游引物5′-AGAGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3′，下游引物5′-CTGGGCCTCGTCGCCCACATA-3′。擴增結果采用ΔΔCt法計算相對定量。

1.5 蛋白質印跡檢測COTE1蛋白表達

收集相應處理后的細胞，用預冷PBS清洗3次；每孔加入100 μL RIPA細胞裂解液和1 μL cocktail蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min；用細胞刮刀刮取細胞，4℃行13 000 r/min離心15 min；取上清液，BCA法測蛋白濃度?？偟鞍仔?0% SDS-PAGE，濕轉1.5 h至PVDF膜；用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h；加入羊抗人COTE1抗體(1 ∶200)、GAPHD抗體(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次10 min；加入相應的HRP標記的二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h；再洗膜3次；采用ECL化學發(fā)光試劑顯色。

1.6 CCK-8法檢測細胞抑制率

將shRNA組及對照組細胞分別以每孔1×104個接種于96孔板，待細胞貼壁后，加入不同濃度的多柔比星(終濃度為0，0.125，0.25，0.5，1.0 μg/mL)培養(yǎng)48 h；每孔加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)2 h；用酶標儀檢測D(450 nm)值；每個濃度設置3個復孔。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡率

將shRNA組及對照組細胞分別以每孔2×105個接種于6孔板中，各設3個復孔，待細胞貼壁后，加入多柔比星使終濃度為0.25 μg/mL，培養(yǎng)48 h；按照Annexin V-Alexa Fluor647/PI凋亡試劑盒說明步驟收集細胞，進行流式細胞術檢測。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 慢病毒轉染

慢病毒轉染細胞并經過0.1 μg/mL嘌呤霉素篩選1周后，熒光顯微鏡下幾乎全部細胞均可見綠色熒光，提示慢病毒轉染成功。見圖1。

圖1 熒光顯微鏡下熒光蛋白的表達(200×)

2.2 慢病毒感染后肝癌細胞中COTE1 mRNA及蛋白的表達

實時熒光定量PCR顯示，shRNA組COTE1 mRNA表達較對照組顯著降低(t=10.329，P<0.05)；進一步蛋白質印跡結果顯示shRNA組COTE1蛋白表達也明顯降低(t=3.459，P<0.05)，見圖2。由此表明，shRNA組的目的基因COTE1被抑制，可進行后續(xù)實驗。

圖2 實時定量PCR和蛋白質印跡法檢測COTE1-shRNA的干擾效果

2.3 COTE1-shRNA對肝癌細胞增殖的影響

CCK-8檢測結果顯示，肝癌細胞經慢病毒感染后，多柔比星對細胞的增殖抑制率明顯高于對照組(P<0.05)，且呈濃度依賴性。見圖3。

*：P<0.05

2.4 COTE1增強多柔比星對細胞凋亡的誘導作用

流式細胞術檢測結果顯示，經多柔比星處理后，shRNA組細胞凋亡率較對照組明顯升高(t=-4.038，P<0.05)，見圖4。由此表明，抑制COTE1表達可促進肝癌細胞凋亡。

3 討論

文獻表明，慢病毒載體具有轉染率高，持續(xù)時間長等優(yōu)點，能實現目的蛋白長期、穩(wěn)定的有效表達[9]。本實驗通過將攜帶有COTE1基因干擾序列的慢病毒載體感染肝癌PLC/PRF/5細胞，并在嘌呤霉素的篩選下得到COTE1基因穩(wěn)定沉默表達的細胞，最后驗證目的基因COTE1表達被顯著抑制。

圖4 流式細胞術檢測兩組肝癌細胞株的凋亡率

既往研究發(fā)現，癌基因在耐藥細胞株中表達較親本細胞升高或降低，而利用反義寡聚核苷酸下調這些基因的表達，促進凋亡蛋白或凋亡通路因子的激活，能夠增強腫瘤的化療增敏作用。如通過干擾大腸癌SW480細胞中HSPA27表達，能夠提高5-氟尿嘧啶對腫瘤細胞的促凋亡作用，增強細胞對化療藥物的敏感性[10]。本實驗研究結果表明，與對照組相比，不同濃度多柔比星處理后shRNA組細胞的增殖抑制率均明顯升高，表明抑制COTE1表達能夠增強多柔比星對肝癌細胞的化療作用。同時，多柔比星處理后的細胞凋亡率也明顯高于對照組，提示COTE1能夠通過促進細胞凋亡來增強化療藥物的抗腫瘤效果，逆轉細胞耐藥，但其通過何種途徑，有待進一步實驗研究。

綜上所述，抑制COTE1表達能夠增強肝癌細胞對多柔比星的化療敏感性，逆轉肝癌細胞耐藥。