毛正發(fā)，徐進(jìn)，季佩宇，王旭青，張建新，周小明

(1. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科，江蘇 鎮(zhèn)江212001； 2. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013)

微管是細(xì)胞骨架的成分之一，參與細(xì)胞中許多重要的生理過程。它可以維持細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[1]，參與細(xì)胞分裂[2]、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]，還可以通過其運動蛋白發(fā)揮轉(zhuǎn)運功能[4]。微管在其他生物過程如細(xì)胞極性、遷移中也起著重要作用[5]。微管組裝的動態(tài)平衡受微管穩(wěn)定相關(guān)蛋白的調(diào)控如促微管解聚蛋白、促微管聚合蛋白、微管切割蛋白等，同時作為細(xì)胞骨架的成分，也受多種激酶的調(diào)控，如Ras同源基因家族成員A(Ras homolog gene family member A,RhoA) GTP酶等[1]。微管組裝的動態(tài)平衡異常參與多種癌的發(fā)生和發(fā)展。據(jù)報道，促微管解聚蛋白Stathmin1可能通過促進(jìn)微管解聚而影響細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移，在許多人類癌癥組織及細(xì)胞系中其表達(dá)上調(diào)，如乳腺癌[6]、前列腺癌[7]、肝細(xì)胞癌[8]。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶，由mTORC1和mTORC2兩種復(fù)合物組成，它們參與細(xì)胞的各種活動，如增殖、能量代謝等，同時可以通過調(diào)控多種信號通路及自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene，ATGs)調(diào)節(jié)自噬，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，在細(xì)胞生長中發(fā)揮重要作用[9]。已有研究報道m(xù)TORC2參與了微管的調(diào)節(jié)并影響其穩(wěn)定性[10]。但mTORC1是否也有相同功能尚不清楚，本研究探討了mTORC1對微管穩(wěn)定性的影響及其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人多克隆抗α-微管蛋白抗體，促微管解聚藥物諾考達(dá)唑(美國Sigma Aldrich公司)。抗-p190RhoGAP，抗-RhoA、stathmin、Katanin、Spastin、KIF2A、CLIP170抗體(加拿大Santa Cruz公司)。人多克隆ATG5抗體，抗P70S6K、抗P-P70S6K(T389)抗體(美國Cell Signaling Technology公司)。mTORC1抑制劑雷帕霉素(美國MCE公司)。其他化學(xué)品均為美國Sigma 公司或Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人子宮頸癌Hela細(xì)胞株置于Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中，于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基補充有10%胎牛血清、2 mmol/mL谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素。

1.3 免疫熒光檢測雷帕霉素處理后Hela細(xì)胞的微管穩(wěn)定性

將Hela細(xì)胞鋪板于蓋玻片上36 h，長至80%融合時，處理組使用50 nmol/L雷帕霉素預(yù)處理24 h后，加入諾考達(dá)唑5 μmol分別處理30、60、120 min；對照組細(xì)胞僅加入諾考達(dá)唑進(jìn)行處理。在室溫下用PBS洗滌細(xì)胞3次，并在冰上用4%多聚甲醛固定30 min。用含有5%山羊血清、2%驢血清、2% BSA、0.1%Tween-20和0.3%Triton X-100的PBS在室溫下封閉細(xì)胞1 h。PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 min，抗α-微管蛋白(1 ∶500)4 ℃下孵育過夜。PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 min，二抗(Alex Fluro 594-標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG)以1 ∶4 000稀釋度常溫下孵育2 h。PBS清洗細(xì)胞3次，每次10 min。用PBS稀釋的DAPI染液(1 ∶3 000)室溫避光孵育15 min。孵育結(jié)束后用PBS清洗細(xì)胞5次，每次5 min。使用倒置共聚焦激光顯微鏡拍照。

1.4 蛋白質(zhì)印跡檢測雷帕霉素處理后Hela細(xì)胞微管穩(wěn)定性相關(guān)蛋白的表達(dá)

將Hela細(xì)胞分別種于兩個培養(yǎng)皿，長至80%融合時，處理組加入50 nmol/L雷帕霉素，對照組不加。24 h后收集細(xì)胞，使用RIPA緩沖液裂解并進(jìn)行蛋白定量，根據(jù)檢測蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量配制相應(yīng)濃度的分離膠及濃縮膠。蛋白質(zhì)變性后行SDS-PAGE，70 V 2 h；350 mA轉(zhuǎn)膜2 h，將凝膠分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(PVDF)上。PVDF膜洗滌后5% BSA封閉1 h；抗stathmin、KIF2A、P70S6K、P-P70S6K(T389)、CLIP170、Katanin、Spastin抗體按說明書稀釋，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加HRP偶聯(lián)的二抗(1 ∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，然后用ECL試劑盒曝光檢測蛋白的表達(dá)。

1.5 免疫熒光檢測ATG5敲減后Hela細(xì)胞的微管穩(wěn)定性

1.5.1 質(zhì)粒構(gòu)建 針對ATG5的小干擾RNA(sh-RNA)由Sigma-Aldrich公司設(shè)計和合成，組裝至pLKO1-TRC克隆載體。ATG5-shRNA-pLKO1序列：正向引物5′-CCGGCCTTTCATTCAGAAGCTGTTTCTC-GAGAAACAGCTTCTGAATGAAAGGTTTTTG-3′，反向引物5′-AATTCAAAAACCTGAACAGAATCATCCTT-AACTCGAGTTAAGGATGATTCAGG-3′。ATG5- scramble-pLKO1序列：正向引物 5′-CCGGCCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGGAGGGCGACTTAACCTTA-GGTTTTTG-3′，反向引物 5′-AATTCAAAAACCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTT AACCTTAGG-3′。

1.5.2 蛋白質(zhì)印跡驗證ATG5的干擾效率 使用293T細(xì)胞進(jìn)行ATG5-shRNA及ATG5- Scramble (隨機序列)質(zhì)粒慢病毒的包裝。將完整病毒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，感染體系為1 mL正常培養(yǎng)基+1 mL病毒上清液，再加入2 μL聚凝胺(10 mg/mL)增強病毒感染細(xì)胞的效率。24 h后再次感染。隨后用濃度為1 μg/mL的嘌呤霉素選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，挑取單克隆，通過蛋白質(zhì)印跡檢測ATG5干擾效率，方法同步驟“1.4”，一抗使用抗ATG5抗體，以GAPDH為內(nèi)參。

1.5.3 免疫熒光檢測微管穩(wěn)定性 轉(zhuǎn)染ATG5-scramble和ATG5-shRNA的Hela細(xì)胞分別加入諾考達(dá)唑5 μmol，處理0、30、60 min后，免疫熒光檢測Hela細(xì)胞的微管穩(wěn)定性，方法同步驟“1.3”。

1.6 免疫熒光檢測 RhoA在mTORC1調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定性中的作用

1.6.1 蛋白質(zhì)印跡檢測雷帕霉素處理后Hela細(xì)胞RhoA的表達(dá) 將Hela細(xì)胞分別種于兩個培養(yǎng)皿，長至80%融合時，處理組加入50 nmol/L雷帕霉素，對照組不加。24 h后收集細(xì)胞，蛋白質(zhì)印跡檢測RhoA的表達(dá)，方法同步驟“1.4”，一抗使用抗RhoA抗體，以GAPDH為內(nèi)參。

1.6.2 RhoA活化實驗 細(xì)胞分為對照組(未處理)，雷帕霉素+諾考達(dá)唑處理組，雷帕霉素+諾考達(dá)唑+LPA(溶血磷脂酸，增加細(xì)胞RhoA活性)刺激處理組，雷帕霉素+諾考達(dá)唑+GFP RhoA-Q63L(RhoA正性質(zhì)粒，具有RhoA活性)處理組。細(xì)胞處理120 min后，免疫熒光檢測活化RhoA對微管穩(wěn)定性的影響，方法同步驟“1.3”。

1.6.3 RhoA抑制實驗 細(xì)胞分為對照組(未處理)，諾考達(dá)唑處理組，諾考達(dá)唑+Y-27632(RhoA下游效應(yīng)物的抑制劑)處理組，諾考達(dá)唑+GFP RhoA-N19處理組(RhoA負(fù)性質(zhì)粒，抑制RhoA活性)。細(xì)胞處理120 min后，免疫熒光檢測抑制RhoA對微管穩(wěn)定性的影響，方法同步驟“1.3”。

1.7 免疫熒光檢測p190RhoGAP在mTORC1調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定性中的作用

使用293T細(xì)胞進(jìn)行病毒的包裝。使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染針對人p190Rho-GAP(正向引物：5′-GAACAGCGAUUUAAAGCAUTT-3′，反向引物：3′-AUGCUUUAAAUCGCUGUUCTT-5′)的對照siRNA(隨機序列)或siRNA。將完整病毒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞24 h后，蛋白質(zhì)印跡檢測干擾效率，一抗為抗p190Rho-GAP抗體，以α-微管蛋白為內(nèi)參。

細(xì)胞分為雷帕霉素+諾考達(dá)唑組，雷帕霉素+諾考達(dá)唑+p190RhoGAP 隨機序列組，雷帕霉素+諾考達(dá)唑+p190RhoGAP-siRNA組。各組細(xì)胞處理120 min后，免疫熒光檢測抑制RhoA對微管穩(wěn)定性的影響，方法同步驟“1.3”。

2 結(jié)果

2.1 雷帕霉素作用后Hela細(xì)胞微管的穩(wěn)定性

用5μmol的諾考達(dá)唑處理后，Hela細(xì)胞中微管的解聚呈時間依賴性，30 min微管開始出現(xiàn)解聚，120 min后微管完全解聚。用50 nmol/L雷帕霉素預(yù)處理后，諾考達(dá)唑誘導(dǎo)的解聚作用被延遲，120 min時仍能清楚地看到微管(圖1)。雷帕霉素能夠抑制諾考達(dá)唑引起的微管解聚，這表明mTORC1可能參與微管的穩(wěn)定性。

圖1 免疫熒光觀察Hela細(xì)胞微管的穩(wěn)定性(×200倍)

2.2 霉帕霉素作用后Hela細(xì)胞微管穩(wěn)定性相關(guān)蛋白的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，用50 nmol/L雷帕霉素處理Hela 24 h后，P-P70S6K(T389)表達(dá)減少，這表明mTORC1信號傳導(dǎo)受到抑制；促微管解聚蛋白質(zhì)(stathmin、KIF2A)，促進(jìn)微管聚合蛋白質(zhì)(CLIP170)和微管切割蛋白(Katanin、Spastin)的表達(dá)未見明顯差異，見圖2。這表明mTORC1調(diào)節(jié)微管的穩(wěn)定性可能與微管穩(wěn)定性相關(guān)蛋白無關(guān)。

圖2 雷帕霉素處理后Hela細(xì)胞微管穩(wěn)定性相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.3 ATG5基因敲低后Hela細(xì)胞的微管穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)印跡(圖3A)顯示，轉(zhuǎn)染ATG5-shRNA后Hela細(xì)胞ATG5蛋白表達(dá)下降，提示細(xì)胞自噬功能得到抑制。與對照細(xì)胞30 min和60 min相比，在ATG5敲低的Hela細(xì)胞中，諾考達(dá)唑誘導(dǎo)的微管解聚沒有顯著差異(圖3B)。結(jié)果表明，Hela細(xì)胞的微管穩(wěn)定性可能與ATG5基因無關(guān)。

圖3 免疫熒光檢測下調(diào)ATG5后Hela細(xì)胞微管的穩(wěn)定性(×200倍)

2.4 RhoA活性在mTORC1調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定性中的作用

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，50 nmol/L雷帕霉素處理24 h后，Hela細(xì)胞 RhoA表達(dá)下降，提示雷帕霉素可能通過下調(diào)RhoA維持微管的穩(wěn)定性(圖4A)。RhoA活化實驗結(jié)果顯示，與雷帕霉素+諾考達(dá)唑處理組相比，使用LPA刺激或轉(zhuǎn)染GFP RhoA-Q63L上調(diào)RhoA后，Hela細(xì)胞的微管解聚加快，120 min 后完全消失(圖4B)。RhoA抑制實驗結(jié)果顯示，與諾考達(dá)唑組相比，使用Y-27632處理或轉(zhuǎn)染GFP RhoA-N19重組RhoA質(zhì)粒抑制RhoA活性后，Hela細(xì)胞的微管解聚被抑制，120 min后微管仍然明顯可見(圖4C)。這些結(jié)果表明RhoA信號傳導(dǎo)途徑參與了Hela細(xì)胞微管穩(wěn)定性的改變。

(A) 雷帕霉素處理后Hela細(xì)胞RhoA表達(dá)下降；(B) RhoA活化實驗，1：對照組(未處理)，2：雷帕霉素+諾考達(dá)唑處理組，3：雷帕霉素+諾考達(dá)唑+LPA處理組，4：雷帕霉素+諾考達(dá)唑+GFP RhoA-Q63L處理組；(C) RhoA抑制實驗，5：對照組(未處理)，6：諾考達(dá)唑處理組，7：諾考達(dá)唑+Y-27632處理組，8：諾考達(dá)唑+GFP RhoA-N19處理組

圖4 免疫熒光檢測RhoA 活化和抑制后Hela細(xì)胞的微管穩(wěn)定性(×200倍)

2.5 p190RhoGAP在mTORC1調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定性中的作用

蛋白質(zhì)印跡顯示，轉(zhuǎn)染p190RhoA-siRNA質(zhì)粒后，Hela細(xì)胞p190RhoGAP表達(dá)下調(diào)；免疫熒光結(jié)果顯示，與雷帕霉素+諾考達(dá)唑+p190RhoGAP隨機序列組相比，轉(zhuǎn)染p190RhoA-siRNA組細(xì)胞微管解聚加快，120 min 后完全消失(圖5)。

1：雷帕霉素+諾考達(dá)唑組，2：雷帕霉素+諾考達(dá)唑+p190RhoGAP 隨機序列組，3：雷帕霉素+諾考達(dá)唑+p190RhoGAP-siRNA組

圖5 免疫熒光檢測抑制 p190RhoGAP后Hela細(xì)胞的微管穩(wěn)定性(×200倍)

3 討論

目前，研究微管穩(wěn)定性的常用方法是通過熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察微管的結(jié)構(gòu)。誘導(dǎo)微管解聚有兩種主要方法：低溫處理和藥物處理[11]。諾考達(dá)唑是一種特異性結(jié)合β-微管蛋白的藥物，可誘導(dǎo)微管解聚。在實驗使用雷帕霉素特異性抑制mTORC1，觀察由諾考達(dá)唑誘導(dǎo)的微管解聚的變化。結(jié)果顯示雷帕霉素預(yù)處理后Hela細(xì)胞中微管的解聚速率明顯慢于未處理的細(xì)胞，即抑制mTORC1提高了微管的穩(wěn)定性。上述結(jié)果表明mTORC1活性參與微管的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)。

mTORC1最重要的作用之一是調(diào)節(jié)自噬[12]。為了研究微管穩(wěn)定性和自噬之間是否存在關(guān)系，我們構(gòu)建了ATG5敲低Hela細(xì)胞系，結(jié)果顯示在ATG5敲低Hela細(xì)胞中，諾考達(dá)唑誘導(dǎo)的微管解聚沒有顯著變化。該結(jié)果提示自噬依賴于穩(wěn)定的微管，但微管的穩(wěn)定性不依賴于自噬。

微管的穩(wěn)定性受微管相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)，例如促進(jìn)微管解聚的stathmin和KIF2A，以及促進(jìn)微管聚合的MAPs、CLIP170。本研究中，抑制mTORC1活性后微管解聚蛋白stathmin、KIF2A和微管聚合蛋白CLIP170均未見明顯變化，微管裂解蛋白(Katanin、 Spastin)亦未見明顯改變。已有研究表明GTP結(jié)合蛋白RhoA介導(dǎo)細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞運動[13]，因此，我們進(jìn)一步觀察RhoA是否直接參與雷帕霉素在Hela細(xì)胞中誘導(dǎo)的微管穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，雷帕霉素處理后Hela細(xì)胞RhoA表達(dá)下降；隨后使用RhoA信號傳導(dǎo)途徑的抑制劑或激活劑刺激細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)mTORC1調(diào)節(jié)微管的穩(wěn)定性與小GTP酶RhoA的激活有關(guān)。有研究表明RhoA活性的下調(diào)與GTP酶活化蛋白如p190RhoGAP的激活有關(guān)[14]，提示雷帕霉素可能是通過增加p190RhoGAP的活性抑制RhoA活性，從而維持微管的穩(wěn)定性。本研究中沉默了p190RhoGAP基因后，Hela細(xì)胞微管解聚的能力得到部分恢復(fù)。綜上所述，本研究結(jié)果顯示mTORC1通過調(diào)控RhoA活性參與微管穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)，與其自噬功能無關(guān)。