邱莎麗，劉雪，汪竹濤，王蓉，晁天柱，王晶哲，潘子輝，梁銀明，王薈，劉霞，邵啟祥

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院免疫遺傳工程實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類存在于細(xì)胞中的內(nèi)源性短小非編碼RNA，長度18～21 kb[1]。miRNA功能廣泛，參與調(diào)控哺乳動物的個體發(fā)育、細(xì)胞分化和介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)等生命過程中的重要事件[2]。機(jī)體的某些疾病，如自身免疫性疾病或腫瘤，與多種miRNA異常表達(dá)密切相關(guān)[3]。miR-34為種屬保守的miRNA，在脊椎動物中進(jìn)化為3種同源基因：miR-34a、miR-34b和miR-34c[4]。miR-34a初級轉(zhuǎn)錄本含有兩個外顯子，之間間隔一個約30 kb的內(nèi)含子，編碼成熟的miR-34a序列位于第二外顯子；miR-34a不參與編碼任何其他非編碼RNA或蛋白質(zhì)[5]。在細(xì)胞衰老、細(xì)胞周期阻滯及凋亡的生物過程中，miR-34a是關(guān)鍵的調(diào)控因素[6-8]。研究表明，在自身免疫性疾病中miR-34a表達(dá)上調(diào)，但其作用及機(jī)制尚未完全闡明[9]。有研究報道m(xù)iR-34a對B細(xì)胞中特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子Foxp1具有顯著的調(diào)節(jié)作用，可導(dǎo)致B細(xì)胞發(fā)育異常，從而引起彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤等惡性淋巴細(xì)胞白血病[10]。miR-34a在復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化癥患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，作用機(jī)制是miR-34a抑制Wnt1，通過其下游TCF-RORγt途徑促進(jìn)樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞分化為經(jīng)典樹突狀細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞，并分泌IL-17a抑制經(jīng)典樹突狀細(xì)胞活化CD4+T細(xì)胞[11]。本實(shí)驗(yàn)室近期研究表明，miR-34a能夠負(fù)向調(diào)控Foxp3表達(dá)，導(dǎo)致Treg/Th17細(xì)胞比例失衡，加重膠原蛋白誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型動物的病情[12]。上述研究表明，在T、B、樹突狀細(xì)胞的分化成熟階段過程中，miR-34a起重要作用。由此推測miR-34a異常表達(dá)通過多種機(jī)制參與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。但是，miR-34a與CIA之間的關(guān)系尚不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立miR-34a基因敲除小鼠模型，并繁育，同時對其相應(yīng)生物學(xué)性狀進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級DBA1/J小鼠，10周齡，雄鼠7只，雌鼠30只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，共37只。合格證編號：11400700245592。

質(zhì)粒：PX260、PX330包含人源化Cas9、crRNA、tracrRNA序列(美國Addgene公司)；MssⅠ(PmeⅠ)酶、T7核酸轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司)；M2培養(yǎng)基、M16培養(yǎng)基(美國Millipore公司)；鼠尾基因型快速鑒定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；PCR試劑 (上海翊圣生物科技有限公司)；熒光素標(biāo)記抗體均購自美國Biolgend公司：抗鼠CD3-FITC、抗鼠CD4-PE、抗鼠CD8a-Percp-Cy5.5、抗鼠CD45-APC、抗鼠CD19-PE；實(shí)驗(yàn)中所采用的引物由上海生工生物工程合成，序列見表1；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒(寶生物生物工程有限公司)；異丙醇、氯仿、無水乙醇(上海國藥集團(tuán))。

梯度PCR儀、實(shí)時熒光定量PCR儀、瓊脂糖凝膠電泳儀(美國Bio-Rad有限公司)；CytoFLEX流式細(xì)胞儀(貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司)。

1.2 miR-34a基因敲除DBA1/J小鼠的構(gòu)建

1.2.1 CRISPR/Cas9靶向位點(diǎn)的設(shè)計及Cas9 mRNA和sgRNA的制備 選擇在線設(shè)計工具(http://crispor.tefor.net/crispor.cgi)，設(shè)計針對miR-34a特異性打靶位點(diǎn)的單鏈引導(dǎo)RNA(single guide RNA，sgRNA)序列。為確保能完全敲除miR-34a的基因組DNA序列，本實(shí)驗(yàn)選擇3個特異性sgRNA序列，其基因組位置見圖1，序列見表1。此3個特異性sgRNA覆蓋miR-34a外顯子，當(dāng)其同時發(fā)揮作用對基因組DNA進(jìn)行切割時，可保證將miR-34a外顯子(tgactgcgggcgcctcagcctgggctggCCAGCTGTGAGTAATT-CTTTGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGTTGTGAGTATTA-GCTAAGGAAGCAATCAGCAAGTATACTGCCCTAG-AAGTGCTGCACATTGTtgggccgag)完全剔除。用限制性內(nèi)切酶PmeⅠ消化的線性化質(zhì)粒pT7-3×Flag-hCas9作Cas9 mRNA體外轉(zhuǎn)錄的模板，按照T7核酸轉(zhuǎn)錄試劑盒說明行體外轉(zhuǎn)錄。

1.2.2 sgRNA和Cas9 mRNA顯微注射入小鼠受精卵 采用顯微操作系統(tǒng)將Cas9 mRNA(50 ng/μL)和sgRNA(50 ng/μL)共注射至DBA1/J小鼠受精卵的胞質(zhì)中；注射后的受精卵細(xì)胞用M2培養(yǎng)基洗滌3次；用覆蓋有胚胎培養(yǎng)用礦物油的50 μL M16培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞發(fā)育至兩細(xì)胞胚胎階段時，將其轉(zhuǎn)移至10周齡ICR假孕雌鼠(轉(zhuǎn)種前一晚與輸精管結(jié)扎的ICR雄鼠合籠交配)的輸卵管壺腹部(每個輸卵管轉(zhuǎn)種10～20個胚胎)。F0代小鼠出生6周后，剪尾，提取基因組DNA行PCR擴(kuò)增鑒定。

1.2.3 miR-34a基因敲除小鼠的飼養(yǎng)、繁殖 小鼠飼養(yǎng)于IVC小鼠飼養(yǎng)籠系統(tǒng)(蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動物設(shè)備有限公司)內(nèi)，溫度為26 ℃，濕度控制為30%～60%。設(shè)置2個繁殖籠，每個繁殖籠用1只經(jīng)CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行全基因組miR-34a基因敲除的DBA1/J F0小鼠和3只DBA1/J野生型小鼠配對進(jìn)行繁殖，對其子代F1小鼠基因型行PCR鑒定，將得到的基因型為miR-34a-/+的F1代雌雄小鼠進(jìn)行合籠繁殖，得到F2代小鼠，并對其miR-34a表達(dá)量進(jìn)行檢測鑒定。

表1 miR-34a實(shí)時定量PCR引物和sgRNA序列

圖1 sgRNA針對的miR-34a序列在基因組上的位置

1.2.4 miR-34a基因敲除小鼠鑒定 采用試劑盒提取繁殖小鼠的鼠尾DNA，行PCR擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min；結(jié)束反應(yīng)，4 ℃保存，引物序列見表1。取10 μL產(chǎn)物進(jìn)行2.5%瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物。利用Trizol提取小鼠淋巴結(jié)和脾臟的淋巴細(xì)胞總RNA，用熒光定量PCR對miR-34a的表達(dá)水平行定量分析。方法簡述如下：cDNA合成42 ℃ 2 min，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，結(jié)束反應(yīng)，4 ℃保存。miR-34a采用專用引物反轉(zhuǎn)錄，U6采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的Oligo dT引物。熒光定量PCR程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，39個循環(huán)。采用ΔCt法對結(jié)果進(jìn)行分析，引物序列見表1。

1.2.5 miR-34a基因敲除小鼠基因測序鑒定 標(biāo)記新生F2代小鼠鼠耳，按照試劑盒廠商提供的實(shí)驗(yàn)步驟操作提取基因組DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表1，送往上海生工生物進(jìn)行測序，對比序列對繁殖的小鼠進(jìn)行鑒別。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)分析miR-34a基因敲除鼠體內(nèi)T、B淋巴細(xì)胞比例 將野生型和miR-34a-/-DBA1/J小鼠麻醉處死，取外周血、脾臟、胸腺、淋巴結(jié)，置于冰上；制備單個細(xì)胞懸液，分別取106個細(xì)胞置于1.5 mL離心管中；1 000 r/min離心10 min，棄上清液；用100 μL PBS重懸細(xì)胞，分別加入0.25 μL熒光標(biāo)記抗體，T細(xì)胞(CD45、CD3、CD4、CD8)，B細(xì)胞(CD45、CD19)，4 ℃避光孵育30 min；用1 mL PBS洗去未結(jié)合抗體，1 000 r/min離心洗滌10 min；200 μL PBS重懸細(xì)胞懸液，用100目篩網(wǎng)過濾于流式管中，上機(jī)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用Graphad Prism 5.0軟件進(jìn)行制圖，采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建的F0代小鼠鑒定結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，圖中1～6為6只F0代DBA1/J小鼠鑒定結(jié)果，DBA1/J野生型小鼠DNA片段為419 bp，獲得2只；miR-34a-/-DBA1/J小鼠的DNA片段為376 bp或者381 bp，獲得2只；而miR-34a-/+DBA1/J小鼠DNA片段為419 bp和376 bp或者419 bp和280 bp，獲得2只。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：缺失43 bp，靶基因序列為376 bp； 2：缺失38 bp，序列為381 bp； 3：缺失139 bp，序列分別為419 bp和280 bp；4、6：序列無缺失，為419 bp；5：缺失43 bp，分別為419 bp和376 bp；7：空白對照；8：WT對照，為419 bp

圖2 F0代DBA1/JmiR-34a-/-小鼠PCR鑒定

2.2 F1代小鼠鑒定與繁育情況

結(jié)果顯示，圖中1～11為繁殖的F1代DBA1/J小鼠11只，對其行基因鑒定，獲得4只miR-34a-/+小鼠，DNA片段為419 bp和280 bp。F1代miR-34a-/+小鼠皮膚及毛發(fā)均為灰色，相對于野生型的DBA1/J小鼠而言，其3～10周體重增加并沒有明顯差異(P>0.05 ，n=4)。見圖3和圖4。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；1～5、8、11：序列分別為419 bp；6、7、9、10：缺失139bp，序列分別為419 bp和280 bp；12：空白對照

圖3 繁殖的F1代DBA1/J小鼠基因鑒定

圖4 繁殖的F1代DBA1/J小鼠年齡與體重關(guān)系曲線

2.3 F2代小鼠鑒定與繁育情況

結(jié)果顯示，1～10是繁殖的F2代小鼠10只，對其行基因鑒定，獲得5只miR-34a-/-小鼠，靶基因缺失139 bp，DNA片段為280 bp，和野生型DBA1/J小鼠相比較，miR-34a-/-小鼠皮膚及毛發(fā)均為灰色，同時體重生長速度沒有顯著的差異(P>0.05，n=5)。見圖5和圖6。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；1～5：缺失139 bp，序列為280 bp；6、8、9：缺失139 bp，序列分別為419 bp和280 bp；7：缺失43 bp，序列分別為419 bp和376 bp；10：序列為419 bp；11：空白對照

圖5 繁殖的F2代DBA1/J小鼠基因鑒定

圖6 繁殖的F2代DBA1/J小鼠年齡與體重關(guān)系曲線

2.4 F2代小鼠測序、miR-34a表達(dá)與繁育情況

基因測序結(jié)果表明，F(xiàn)2代miR-34a-/-小鼠基因組DNA中缺失miR-34a基因序列，缺失片段為139 bp，而在野生型小鼠體內(nèi)存在miR-34a基因序列，表明敲除小鼠miR-34a基因確實(shí)已被敲除。同時發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠皮膚、毛色、繁殖情況和正常小鼠并沒有差異。定量PCR檢測結(jié)果顯示，miR-34a-/-小鼠不表達(dá)miR-34a，而野生型小鼠表達(dá)正常水平的miR-34a(P<0.01)，見圖7。

圖7 F2代DBA1/J miR-34a-/-小鼠表觀遺傳分析

2.5 miR-34a基因敲除鼠T、B淋巴細(xì)胞比例

結(jié)果顯示，胸腺、脾臟、淋巴結(jié)、外周血中CD4+、CD8+T細(xì)胞的比例和野生型小鼠比較沒有明顯差別(P>0.05)。在脾臟、淋巴結(jié)和外周血中，敲除鼠體內(nèi)總B細(xì)胞總數(shù)比例較野生型明顯增加(P<0.05)。見圖8、圖9。

圖8 DBA1/J miR-34a-/-小鼠中T細(xì)胞表型分析

3 討論

CRISPR/Cas9是近年來發(fā)展起來的一種基因敲除技術(shù)，它主要利用特異性的sgRNA引導(dǎo)、定位和識別目的基因特異性位點(diǎn)，并將Cas9的核酸酶定位到基因組上的靶點(diǎn)，對目的基因位點(diǎn)進(jìn)行切割，誘導(dǎo)這些基因位點(diǎn)發(fā)生缺失突變。這種方法能夠?qū)蚪MDNA的大片段進(jìn)行刪除，同時不影響其他內(nèi)源性基因發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)功能[13-14]。本實(shí)驗(yàn)室利用CRISPR/Cas9技術(shù)，成功構(gòu)建miR-34a-/-DBA1/J小鼠。在繁殖過程中未發(fā)現(xiàn)敲除小鼠和野生型小鼠在外觀、體重、生長速度、繁殖能力等方面有明顯差異，推測基因組中miR-34a敲除后對小鼠的表觀遺傳無明顯影響。通過瓊脂糖凝膠電泳、實(shí)時定量PCR和測序檢測發(fā)現(xiàn)，后續(xù)繁殖的純合子小鼠中miR-34a表達(dá)缺失，表明基因缺失具有穩(wěn)定遺傳性，該種敲除鼠為本實(shí)驗(yàn)室后續(xù)疾病研究提供了穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀RISPR/Cas9 敲除技術(shù)相對于目前利用Foxj1-Cre技術(shù)構(gòu)建的選擇性條件miR-34a-/-小鼠技術(shù)[15]而言，它具有基因組編輯特異性強(qiáng)、打靶效率高、方法操作簡單、實(shí)驗(yàn)周期短、實(shí)驗(yàn)成本低、適用性廣泛等優(yōu)點(diǎn)，可極大地提高構(gòu)建敲除鼠的效率。

圖9 DBA1/J miR-34a-/-小鼠中B細(xì)胞比例表達(dá)分析

miR-34a可通過抑制轉(zhuǎn)錄因子Foxp1干擾B淋巴細(xì)胞發(fā)育，引起惡性淋巴細(xì)胞白血病[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲除鼠胸腺、脾臟、淋巴結(jié)、外周血中CD4+、CD8+T細(xì)胞群體比例沒有顯著變化，而在脾臟、淋巴結(jié)和外周血中，總B細(xì)胞比例明顯增加，表明miR-34a可能對CD4+、CD8+T細(xì)胞的發(fā)育分化沒有顯著影響，但是影響B(tài)細(xì)胞的分化成熟。然而miR-34a在B細(xì)胞的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是最常見的自身免疫性疾病，自身免疫是發(fā)病的核心機(jī)制，還與瓜氨酸化或氨基甲?；揎椀淖陨淼鞍踪|(zhì)的耐受性相關(guān)[11]。目前對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究主要采用DBA1/J小鼠CIA模型。本實(shí)驗(yàn)室研究表明，miR-34a在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)表達(dá)升高，抑制Foxp3表達(dá)，從而導(dǎo)致Treg/Th17比例失衡，促進(jìn)CIA小鼠疾病的進(jìn)展，用miR-34a抑制劑治療時可改善CIA模型動物的癥狀，并延遲癥狀的發(fā)生[12]。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)室利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功構(gòu)建miR-34a敲除的DBA1/J小鼠。