陳 芳 姚翠英 田治國 楊云尉

(武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院整形美容科，武漢 430064)

組織移植是整形外科中常用的組織修復(fù)方法，且隨著材料學(xué)的不斷發(fā)展，為組織修復(fù)提供了新的思路。但是，組織工程移植物血管化的速度相對緩慢，血管化不良在一定程度上限制了組織工程的發(fā)展。同種異體復(fù)合組織移植是臨床上修復(fù)大面積或特殊部位(包括：陰莖、肢體或面部等)組織缺損的重要方法，能有效改善部位形態(tài)，成為修復(fù)重建最為理想的方法之一[1]。近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，冷凍同種異體手指復(fù)合組織移植術(shù)開始用于手外科，燒傷整形及美容等科室中，均能獲得良好效果。但是，移植后多數(shù)患者需要長時間給予的免疫抑制劑，容易增加術(shù)后感染、糖尿病、惡性腫瘤的發(fā)生率[2,3]。因此，如何采取有效的措施降低免疫抑制劑使用劑量，減輕對機(jī)體免疫的影響成為研究的熱點[4,5]。

間充質(zhì)干細(xì)胞是一種多能干細(xì)胞，具有干細(xì)胞的所有特征，即自我更新和多向分化能力。目前，臨床上應(yīng)用相對較多，常與造血干細(xì)胞聯(lián)合使用，有助于提高移植成功率，加速造血重建。臨床研究表明：間充質(zhì)干細(xì)胞不僅存在于骨髓中，亦可存在于骨骼肌、骨外膜與骨小梁中。而脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞是一類特殊的細(xì)胞，具有干細(xì)胞的特性，在同種異體復(fù)合組織移植后免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用，但是其機(jī)制尚未知曉。CC趨化因子受體7(CCR7)屬于一類趨化因子受體，配體為趨化因子配體21(CCL21)(由淋巴器官分泌生成)，且能誘導(dǎo)、表達(dá)CCR7并趨化到脾臟等器官中[6-8]。因此，本文采用隨機(jī)對照方法進(jìn)行研究，探討脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞中CCR7過表達(dá)對BALB/c小鼠異體復(fù)合組織移植早期免疫調(diào)節(jié)的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物資料 取BALB/c小鼠5只進(jìn)行脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的提取、分離及培養(yǎng)，另取2017年5月～2018年1月參與實驗的C57BL6與BALB/c小鼠各30只作為對象，以C57BL6小鼠作為供體獲取皮片，BALB/c小鼠為受體。35只小鼠檢疫合格，雌雄不限，體質(zhì)量200～420 g，平均(310.63±15.66)g。動物合格證號：SCXK-(吉)2007-0003，所選動物均由醫(yī)學(xué)動物實驗中心提供，BALB/c小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，光照12 h，建模前12 h禁食。

1.1.2儀器與設(shè)備 實驗所需儀器與設(shè)備見表1。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞的構(gòu)建 ①脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、提?。簩Ｐ∈筮M(jìn)行精確稱重，腹腔注射濃度10.0%水合氯醛4 ml/kg，待麻醉生效后進(jìn)行常規(guī)消毒、鋪巾。在脂肪相對集中區(qū)域抽取相應(yīng)脂肪2 ml，同時抽取頸動脈血2 ml，將其放置在-20℃冰箱中，備用。完成上述操作后采用PBS對抽取出的脂肪組織進(jìn)行清洗，加入膠原酶液，振動，220 r/min離心15 min。采用PBS對獲得的混懸液進(jìn)行2次清洗，完畢后放入100 mm的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每3 d換液1次，待細(xì)胞融合80.0%時按照1∶5比例進(jìn)行細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞密度5×104ml-1，并將二代細(xì)胞放置在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待融合90.0%后繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，取第三代脂肪干細(xì)胞采用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞標(biāo)記物CD90和CD34[9，10]。②細(xì)胞的構(gòu)建：取第三代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，貼壁后加入10.0%胎牛血清a-MEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度2×105ml-1，分裝在12孔板中，放入培養(yǎng)箱中過夜。結(jié)合試驗需要設(shè)置感染復(fù)數(shù)(MOI)為100，在生物安全柜中向培養(yǎng)基中加入CD197(CCR7)-APC(4B12)慢病毒顆粒包裝試劑，為了提高轉(zhuǎn)染效率可加入聚凝胺2.5 μl/ml，37℃溫箱下靜置，連續(xù)進(jìn)行6 h 轉(zhuǎn)染后首次換液。連續(xù)進(jìn)行5～6 d轉(zhuǎn)染后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的熒光。取傳代擴(kuò)增細(xì)胞，向培養(yǎng)基中加入濃度為4 mg/ml的殺稻瘟菌素1 μl/ml，完成轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選。調(diào)整細(xì)胞密度2×105ml-1，放置在EP管中，4℃避光靜置20 min，利用PBS連續(xù)2次洗滌、備用，見圖1。

表1 儀器與設(shè)備Tab.1 Instruments and equipment

1.2.2動物實驗 ①異體復(fù)合組織移植動物模型的建立。C57BL6小鼠供體獲取皮片，按照小鼠重量常規(guī)腹腔注射戊巴比妥鈉(上海上藥新亞藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H31021724)5 g/L進(jìn)行麻醉，待麻醉生效后進(jìn)行常規(guī)消毒、鋪巾，在無菌條件下采用美蘭劃線并標(biāo)記圓形皮片直徑1.0 cm，沿著劃線區(qū)域完成全層皮片的剪取，給予生理鹽水、紗布覆蓋后備用。BALB/c小鼠受體：根據(jù)上述步驟，對BALB/c小鼠給予常規(guī)麻醉，無菌條件下在背部采用美蘭劃線并標(biāo)記圓形皮片直徑1.0 cm，根據(jù)劃線區(qū)域切除皮膚及皮下組織，形成直徑為1.0 cm的創(chuàng)面，并將C57BL6小鼠供體皮片覆蓋到創(chuàng)面，給予4-0絲線完成縫合、固定，給予無菌棉球加壓、打包覆蓋，采用繃帶包裹、固定，見圖2。②建模后處理。建模成功后分為過表達(dá)CCR7組(CCR7組)、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組(干細(xì)胞組)與對照組。CCR7組建模后經(jīng)尾靜脈注射CCR7脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞1×106、干細(xì)胞組注射脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞1×106、對照組注射等體積生理鹽水，連續(xù)進(jìn)行30 d干預(yù)。

圖1 熒光顯微鏡下細(xì)胞熒光(可見細(xì)胞熒光，轉(zhuǎn)染成功)Fig.1 Cellular fluorescence under fluorescence micros-cope (visible cell fluorescence，successful trans-fection)

圖2 異體復(fù)合組織移植動物模型建立Fig.2 Establishment of animal model of allogeneic composite tissue transplantationNote:A.The formation of wounds in BALB/c mice;B.The packing and sutures after transplantation of allogeneic skin grafts.

1.2.3觀察指標(biāo) ①受體皮片存活面積：分別在小鼠移植后第 3、6、9及30天時進(jìn)行換藥，創(chuàng)面清理后給予塑料紙描邊記錄受體皮片存活的面積[15]。②HE染色：各組BALB/c小鼠30 d干預(yù)完畢后均給予斷頸方式處死，取移植皮片組織，制備5 μm切片，經(jīng)石蠟包埋后進(jìn)行HE染色[16,17]。③細(xì)胞免疫水平：各組BALB/c小鼠30 d干預(yù)后取頸動脈血3 ml，1 129 g離心15 min，血清分離后經(jīng)非特異誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后采用流式細(xì)胞儀測定淋巴細(xì)胞中Th17、Treg、Th1/Th2的細(xì)胞水平[18,19]。④Th1/Th2細(xì)胞因子水平：取上述分離的血清標(biāo)本，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定患者IL-6、IL-2、IL-10、IL-1β及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平。

2 結(jié)果

2.1三組受體皮片存活面積比較 CCR7組干預(yù)后第3、6、9及30天皮片存活面積均大于干細(xì)胞組與對照組(P<0.05)；干細(xì)胞組預(yù)后第3、6、9及30天皮片存活面積均大于對照組(P<0.05)，見圖3和表2。

圖3 三組皮瓣面積存活情況Fig.3 Survival of three groups of flapsNote:A.CCR7 Group；B.Stem cell group；C.Control group.

表2 三組受體皮片存活面積比較

2.2各組HE染色比較 HE染色結(jié)果表明：CCR7組小鼠多數(shù)存在角質(zhì)層，可見毛囊等皮膚附屬器官；干細(xì)胞組角質(zhì)層剝脫，皮膚附屬器官尚未缺失；對照組角質(zhì)層剝脫且皮膚附屬器官缺失，見圖4。

圖4 各組HE染色結(jié)果比較(×200)Fig.4 Comparison of HE staining results of each group (×200)Note:A.The results of HE staining in the CCR7 group;B.The results of HE staining in the stem cell group;C.The result of HE staining in the control group.

2.3三組細(xì)胞免疫水平比較 CCR7組Th17水平均低于干細(xì)胞組和對照組(P<0.05)；CCR7組Treg細(xì)胞水平高于干細(xì)胞組和對照組(P<0.05)；干細(xì)胞組Th17水平低于對照組(P<0.05)； 干細(xì)胞組Treg細(xì)胞水平高于對照組(P<0.05)，見表3和圖5。

表3 三組細(xì)胞免疫水平比較

圖5 三組流式細(xì)胞圖Fig.5 Three sets of flow cytometryNote:A.The CCR7 Group;B.The Stem cell group;C.The Control group.

2.4三組Th1/Th2細(xì)胞因子水平比較 CCR7組IL-6、IL-2、IL-10、IL-1β及TNF-α水平均低于干細(xì)胞組(P<0.05)；干細(xì)胞組IL-6、IL-2、IL-10、IL-1β及TNF-α水平均高于對照組(P<0.05)，見表4。

表4 三組Th1/Th2細(xì)胞因子水平比較

3 討論

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞是一種特殊的細(xì)胞，具有多向分化潛能，能在特定的調(diào)節(jié)下向其他細(xì)胞分化[20]。近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，臨床上對于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)免疫的臨床研究已取得階段性進(jìn)展，但是其免疫抑制作用機(jī)制尚未完全清除[21]。臨床研究表明，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能主要通過分泌各種細(xì)胞因子等產(chǎn)生抑制作用[22]。趨化因子是一種小分子家族蛋白質(zhì)，在腫瘤的發(fā)生、免疫細(xì)胞的應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用[23，24]。CCR7是表達(dá)于細(xì)胞表面的趨化因子受體，而CCL21在其定向誘導(dǎo)表達(dá)中發(fā)揮了重要作用(淋巴結(jié)與脾臟是其主要場所)[25]。臨床研究表明：過表達(dá)CCR7的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞能在次淋巴結(jié)富集[26]。為了進(jìn)一步分析過表達(dá)CCR7脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在小鼠異體復(fù)合組織移植中的免疫作用，本研究中構(gòu)建過表達(dá)CCR7細(xì)胞，并建立小鼠異體復(fù)合組織模型，動物建模成功后注射脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞1×106，結(jié)果表明：CCR7組干預(yù)后第3、6、9及30天皮片存活面積均大于干細(xì)胞組與對照組(P<0.05)，說明過表達(dá)CCR7脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞用于小鼠異體復(fù)合組織模型中能獲得良好的修復(fù)效果，有助于提高皮片的存活率，利于創(chuàng)面的愈合。同時，本文注射劑量為注射脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞1×106，該劑量既不太大，又符合小鼠需要，能獲得良好的修復(fù)效果，但是對于其他劑量脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對修復(fù)效果的影響尚需要進(jìn)一步研究與探討。

Treg是人體重要的免疫系統(tǒng)(視為免疫系統(tǒng)天然干擾器)，其表達(dá)水平能抑制、降低小鼠異體復(fù)合組織移植過程中產(chǎn)生的排斥反應(yīng)，是移植免疫的“信號燈”；而Th17屬于一種輔助性T細(xì)胞，在炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用[27，28]。過表達(dá)CCR7的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞能抑制CD4+細(xì)胞向炎癥Th1細(xì)胞與Th17細(xì)胞分化，能充分體現(xiàn)免疫抑制作用[29]。本研究中，CCR7組Th17水平低于干細(xì)胞組與對照組(P<0.05)；CCR7組Treg細(xì)胞水平高于干細(xì)胞組與對照組(P<0.05)；CCR7組IL-6、IL-2、IL-10、IL-1β及TNF-α水平均低于干細(xì)胞組(P<0.05)；干細(xì)胞組IL-6、IL-2、IL-10、IL-1β及TNF-α水平均高于對照組(P<0.05)。說明過表達(dá)的CCR7具有良好的免疫抑制作用，有助于改善機(jī)體免疫，促進(jìn)移植皮片的存活，利于創(chuàng)面的修復(fù)。臨床研究表明[30]：過表達(dá)的CCR7具有良好的歸巢作用，能避免細(xì)胞在正常組織中潴留，且在次級淋巴結(jié)中能更好地發(fā)揮脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的作用，能實現(xiàn)免疫細(xì)胞接觸抑制，具有更強(qiáng)的免疫抑制作用。本研究中，HE染色結(jié)果表明：CCR7組小鼠多數(shù)存在角質(zhì)層，可見毛囊等皮膚附屬器官；干細(xì)胞組角質(zhì)層剝脫，皮膚附屬器官尚未缺失；對照組角質(zhì)層剝脫且皮膚附屬器官缺失，說明過表達(dá)CCR7脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞用于小鼠異體復(fù)合組織移植中有利于創(chuàng)面的愈合。但是，本研究僅局限于動物實驗，再加上動物數(shù)量較少，獲得的結(jié)論存在一定的偏倚性，均需要進(jìn)一步研究與探討。

綜上所述，注射CCR7脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞1×106L-1對小鼠異體復(fù)合組織移植早期具有更好的免疫抑制作用，有助于提高受體小鼠的生存狀態(tài)。