李寶輝 馬 輝 侯明明 李新萌 陳 虎 孔祥軍

(滄州市中心醫(yī)院中心實驗室，滄州 061001)

肺癌是世界上癌癥相關(guān)死亡的最常見原因之一，非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)作為肺癌的主要亞型占所有病例的70%～80%[1]。雖然肺癌的診斷和治療取得了很大進展，但總體生存率仍然不高，高死亡率可能與早期腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有關(guān)[2]。因此，迫切需要更好地了解NSCLC進展中涉及的分子機制，并為患者找到更有效的治療方法。近年來研究發(fā)現(xiàn)，許多長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)在生物過程中發(fā)揮重要作用，包括細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)移和分化[3-5]。許多失調(diào)的lncRNA參與NSCLC的各種生物學(xué)活性，例如，lncRNA PTV1、MALAT-1和HOTAIR[6-8]。然而，很少有研究關(guān)注富含核的豐富轉(zhuǎn)錄物1(Nuclear enriched abundant transcript 1，NEAT1)在NSCLC中的作用。本研究探討了NEAT1在NSCLC中的潛在功能，并初步分析了其相關(guān)機制，Wnt/β-catenin信號通路在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)展的多個方面(包括NSCLC)中起重要作用，NEAT1是一種新型的lncRNA，在許多癌癥中起著重要的調(diào)節(jié)作用，因此我們進一步探討了NEAT1是否可能參與Wnt/β-catenin信號通路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑及儀器 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、SPCA1和正常細(xì)胞系BESA-2B均購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，Transwell、SOX9及GAPDH一抗購自美國BD公司，RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，Trizol和細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，一步法RT-PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，熒光檢測試劑盒購自美國Promega公司。實驗所用PCR儀為ABI 7500，酶標(biāo)儀為Thermo FC。

1.1.2組織標(biāo)本 收集自2015年1月至2016年12月來我院就診經(jīng)病理學(xué)診斷確診為NSCLC的患者91例，手術(shù)前未進行局部或全身治療，獲取其NSCLC組織和相鄰非腫瘤組織，液氮中快速冷凍后于-80℃超低溫冰箱中保存。本研究已獲得滄州市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2017-139-01)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、SPCA1及正常人肺細(xì)胞系BESA-2B均用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)，48 h消化傳代。分5組進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染：si-NEAT1組、si-NC組(陰性對照組)、miR-101-3p模擬物組、miR-101-3p抑制劑組和si-SOX9組，擴增引物見表1，采用2-ΔΔCt法進行相對定量。

1.2.2MTT實驗 應(yīng)用改良MTT實驗評估細(xì)胞活力，連續(xù)觀測96孔板(5 000細(xì)胞/孔)24 h。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，加入20 μl MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清后加入總共200 μl二甲基亞砜(DMSO)，測量490 nm吸光度。

表1 NEAT1、miR-101-3p擴增引物Tab.1 Amplification primer of NEAT1 and miR-101-3p

1.2.3Transwell實驗 通過Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和浸潤，應(yīng)用Transwell小室檢測細(xì)胞遷移，細(xì)胞浸潤Transwell小室以30 mg/cm2基底膜(BD)包被后于37℃孵育1 h形成基質(zhì)屏障。DMEM稀釋細(xì)胞至1×105細(xì)胞/孔，5%CO237℃孵育24 h后，甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌后，顯微鏡下隨機選取10個視野(200×)計算膜下細(xì)胞數(shù)，重復(fù)3次，侵襲細(xì)胞數(shù)越多表示侵襲能力越強。

1.2.4Western blot實驗 通過免疫印跡實驗檢測NSCLC細(xì)胞中SOX9、β-catenin和c-Myc的表達(dá)情況。培養(yǎng)或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以RIPA緩沖液裂解，BCA法提取蛋白質(zhì)定量，10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后于5%脫脂牛奶(含0.1%吐溫的PBS)孵育1 h，加入anti-SOX9、anti-β-catenin、anti-c-Myc和anti-GAPDH一抗4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000，Abcam)孵育，EMD顯影，GAPDH為蛋白標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1NEAT1在NSCLC組織和細(xì)胞中高表達(dá) 通過qRT-PCR檢測NSCLC組織、癌旁正常組織以及肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和SPCA1中NEAT1 mRNA的表達(dá)，從表2中可見NSCLC組織中NEAT1 mRNA表達(dá)量明顯高于正常組織(P<0.05)，NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549和SPCA1中NEAT1 mRNA表達(dá)量也顯著高于人類正常肺細(xì)胞系BESA-2B(P<0.05)。另外，NEAT1的表達(dá)量與NSCLC患者的TNM分期及淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P=0.000)。

表2 NEAT1在NSCLC中的表達(dá)及與病理分期的關(guān)系(n=91)Tab.2 Relationship of expression of NSCLC with patho-logical stage(n=91)

2.2NEAT1沉默后抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和浸潤 對si-NEAT1轉(zhuǎn)染細(xì)胞進行qRT-PCR檢測，NEAT1的表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.01，圖1A)，MTT實驗也顯示A549和SPCA1轉(zhuǎn)染細(xì)胞與對照組相比NEAT1的表達(dá)受到抑制，NEAT1沉默組細(xì)胞的遷移和浸潤數(shù)量明顯減少，表明NEAT1沉默抑制了NSCLC細(xì)胞的代謝活性(圖1B)。

圖1 NEAT1沉默對NSCLC細(xì)胞代謝活性的影響Fig.1 Effect of NEAT1 silencing on metabolic activity of NSCLC cellsNote:A.The expression of NEAT1 after si-NEAT1 transfection；B.The metabolic activity of NSCLC cells after NEAT1 silenced.

2.3miR-101-3p的表達(dá) 通過檢測si-NEAT1轉(zhuǎn)染細(xì)胞A549和SPCA1中miR-101-3p的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，si-NEAT1轉(zhuǎn)染后miR-101-3p的表達(dá)顯著增高(P<0.05)，然而miR-101-3p的表達(dá)上調(diào)并不影響NEAT1的表達(dá)(P>0.05)，因此推斷miR-101-3p可能是NEAT1的抑制劑靶點(圖2)。

圖2 NEAT1與miR-101-3p的相關(guān)性Fig.2 Correlation of NEAT1 and miR-101-3pNote:A.The expression of miR-101-3p after si-NEAT1 transfection；B.The expression of NEAT1 after miR-101-3p overexpression.

2.4SOX9/Wnt/β-catenin信號通路與NSCLC的關(guān)系 應(yīng)用Western斑點實驗檢測si-SOX9轉(zhuǎn)染A 549和SPCA1細(xì)胞系中的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示，β-catenin和c-Myc的表達(dá)顯著降低，同時在miR-101-3p過量表達(dá)的細(xì)胞中SOX9、β-catenin和c-Myc的表達(dá)顯著降低，而在miR-101-3p受到抑制后其表達(dá)明顯升高，表明NEAT1/miR-101-3p/SOX9/Wnt/β-catenin信號通路在NSCLC發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

圖3 si-SOX9轉(zhuǎn)染及miR-101-3p過量表達(dá)前后β-catenin和c-Myc的表達(dá)情況Fig.3 Expression of β-catenin and c-Myc in NSCLC cells before and after si-SOX9 transfection and miR-101-3p overexpression

3 討論

近年來對于lncRNA的研究越來越多，大量證據(jù)表明其與癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。Mang等[9]報道lncRNA NEAT1通過調(diào)節(jié)hnRNP A2的表達(dá)而促進肝癌的發(fā)生發(fā)展，且該調(diào)控與NEAT1-U2AF65蛋白復(fù)合物有關(guān)，可為肝癌的治療提供潛在靶點。Sun等[6]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1可作為has-miR-377-3p的競爭內(nèi)源性RNA抑制其與E2F3的結(jié)合，是促進NSCLC進展的核心致癌基因，認(rèn)為NEAT1作為內(nèi)源性RNA調(diào)節(jié)E2F3的表達(dá)，建立起了調(diào)節(jié)性miRNA網(wǎng)絡(luò)與NSCLC發(fā)生發(fā)展的聯(lián)系。然而lncRNA NEAT1在NSCLC中的具體作用機制尚不清楚。

NEAT1在多種腫瘤中已有研究，邢宏松等[10]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1在肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)，沉默lncRNA NEAT1表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其機制可能與調(diào)控miR-211/SATB2信號途徑有關(guān)。帥勇鋒等[11]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1在胃癌細(xì)胞株中高表達(dá)，lncRNA NEAT1沉默表達(dá)抑制胃癌增殖并誘導(dǎo)凋亡，可能與p-Akt、bcl-2下調(diào)bax上調(diào)有關(guān)。徐笑宇等[12]檢測宮頸病變患者血清中l(wèi)ncRNA NEAT1的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者NEAT1表達(dá)水平低于健康對照組。潘翔等[13]檢測腎癌組織及其癌旁組織中NEAT1的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)NEAT1在腎癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)，并與癌組織類型、腎癌TNM分期和AJCC分期無明顯相關(guān)性。上述研究表明NEAT1在不同癌癥中分別發(fā)揮著促進和抑制的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)NEAT1在NSCLC中發(fā)揮促進作用，其在NSCLC組織和細(xì)胞中均較正常對照呈高表達(dá)，且NEAT1的表達(dá)與NSCLC的臨床分期密切相關(guān)，NEAT1沉默能夠抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和浸潤。既往研究表明lncRNA能夠調(diào)控miRNA的表達(dá)和活性，Lo等[14]發(fā)現(xiàn)BRCA1/NEAT1/miR-129-5p/WNT4信號通路在乳腺癌中發(fā)揮致癌作用。Wang等[15]發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1通過調(diào)節(jié)miR-107/CDK6途徑促進喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，認(rèn)為NEAT1可作為其治療的潛在靶點。然而lncRNA和miRNA在NSCLC中的研究文獻(xiàn)還很少，尚需大量的研究予以證實。本研究中，我們通過證實了miR-101-3p為NEAT1的抑制靶標(biāo)，下調(diào)NEAT1的表達(dá)能夠增加miR-101-3p的表達(dá)，但是miR-101-3p表達(dá)增高并不能影響NEAT1的表達(dá)，因此認(rèn)為miR-101-3p是NEAT1的直接靶標(biāo)。

Wnt/β-catenin信號通路能夠通過調(diào)節(jié)多功能β-catenin蛋白活性而在多種細(xì)胞間發(fā)揮重要作用，近來研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤進展中Wnt/β-catenin信號通路與SOX9間具有顯著的相關(guān)性，比如Santos等[16]發(fā)現(xiàn)SOX9升高后作用于Wnt信號傳導(dǎo)驅(qū)動胃癌進展，Ma等[17]發(fā)現(xiàn)SOX9驅(qū)動前列腺癌中的Wnt信號通路，Prévostel等[18]發(fā)現(xiàn)SOX9是一種控制Wnt/β-catenin的非典型腸癌抑制因子。本研究發(fā)現(xiàn)SOX9可以作為miR-101-3p的靶標(biāo)，NEAT1通過激活NEAT1/miR-101-3p/SOX9/Wnt/β-catenin軸在NSCLC進展中發(fā)揮致癌作用，因此認(rèn)為NEAT1有望成為NSCLC基因治療的新靶標(biāo)。