李 娜，趙巖巖，周 威，張 浩，胡梁斌，莫海珍，李紅波，3

（1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；3.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州 450001）

木瓜屬薔薇科（Chaenomeles sinensis(Thouin)Koehne），在我國(guó)已有3 000多年的栽培歷史。作為我國(guó)衛(wèi)生部2002年公布87個(gè)的藥食同源名單之一，木瓜含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分。鑒于重要的藥用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景，有必要對(duì)其活性成分進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用。目前，大部分食品活性研究采用了分離純化和鑒定，對(duì)某一組分進(jìn)行活性測(cè)定。這一研究策略忽視了食品作為一個(gè)整體對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將藥物作用相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白納入一個(gè)龐大的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中，從分子水平分析藥物發(fā)揮作用的潛在信號(hào)通路和作用機(jī)制[1]。劉方等人[2]通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了柿果主要活性成分靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)這些靶點(diǎn)主要作用于心血管疾病、神經(jīng)精神性疾病。呂金燕等人[3]通過(guò)構(gòu)建羅漢果止咳化痰病的“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)模型，解析了羅漢果主要活性成分與止咳化痰靶點(diǎn)的作用方式。蘇比努爾·巴克等人[4]采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)虛擬篩選的方法，探討了桑椹多成分協(xié)同防治糖尿病的藥理作用及機(jī)制。

借鑒網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究思路，構(gòu)建木瓜活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)其靶點(diǎn)進(jìn)行功能富集及通路分析，為從分子水平研究木瓜作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，也為從整體上把握食品的功能活性研究提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 木瓜化合物數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/index.php）查找并收集木瓜的潛在活性成分[5]，根據(jù)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)口服生物利用度（Oral bioavailability，OB） 和藥物相似性 （Drug-likeness，DL） 獲取木瓜主要活性成分，通過(guò)ChEMBL（www.ebi.ac.uk/chembl）和PubChem Database（www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound）等化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)檢索木瓜化學(xué)成分的分子結(jié)構(gòu)，構(gòu)建木瓜小分子化合物結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 木瓜化合物潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Pharmmapper Server數(shù)據(jù)庫(kù)（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/）預(yù)測(cè)木瓜主要化合物靶點(diǎn)[6]，進(jìn)一步使用 TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/index.php）和SymMap（http://www.symmap.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)查詢驗(yàn)證木瓜主要化合物靶點(diǎn)[7]，使用Cytoscape構(gòu)建木瓜化合物-靶點(diǎn)分子網(wǎng)絡(luò)，對(duì)其可視化分析。

1.3 木瓜作用靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將篩選到的靶點(diǎn)合并去冗余，導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取靶點(diǎn)之間的相互作用數(shù)據(jù)，然后導(dǎo)入Cytoscape，構(gòu)建木瓜潛在作用靶點(diǎn)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，采用Analyze network工具對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，采用Generate style from statistics工具根據(jù)Degree值的大小設(shè)置靶點(diǎn)的大小和顏色。

表1 木瓜中主要化合物信息

1.4 GO富集分析和KEGG通路注釋分析

為研究化合物可能作用的生物學(xué)通路及靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系，揭示靶點(diǎn)蛋白的相互作用關(guān)系及其在基因功能上的富集情況，將篩選到的分子靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO富集分析和代謝通路注釋分析[8]。使用Cytoscape，根據(jù)靶點(diǎn)分子的通路注釋結(jié)果構(gòu)建靶點(diǎn)分子-通路網(wǎng)絡(luò)圖，對(duì)其可視化分析，解析木瓜作用的生物通路。

1.5 靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證

利用http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/在線網(wǎng)站對(duì)KCNA三維空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬[9]；利用在線生物信息學(xué)網(wǎng)站http://services.mbi.ucla.edu/SAVES/，對(duì)其三維結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)；利用Autodock軟件對(duì)該靶點(diǎn)蛋白與其互作的木瓜分子進(jìn)行對(duì)接研究[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 木瓜中主要化合物分析

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)TCMSP平臺(tái)篩選出89個(gè)化合物，以O(shè)B≥30%和DL≥30%作為篩選條件得到20個(gè)主要活性成分。

木瓜中主要化合物信息見(jiàn)表1。

2.2 木瓜化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

木瓜化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖1。

由圖1可知，木瓜化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)共有199個(gè)節(jié)點(diǎn)，包含了20個(gè)化合物，179個(gè)靶點(diǎn)，其中內(nèi)圈為化合物分子，外圈為靶點(diǎn)分子，線條表示化合物與靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系。該網(wǎng)絡(luò)由248條邊構(gòu)成一個(gè)完整的網(wǎng)絡(luò)，每條邊代表化合物和靶點(diǎn)的相互作用，平均節(jié)點(diǎn)度（degree） 為1.4，其中節(jié)點(diǎn)值排名靠前的化合物有槲皮素、丁香酚、甲基丁香酚、草蒿腦等，節(jié)點(diǎn)值分別為150，29，13，10。

圖1 木瓜化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 木瓜作用靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

對(duì)木瓜化合物的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行合并去冗余后，共得到179個(gè)靶點(diǎn)蛋白。使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取179個(gè)靶點(diǎn)相互作用關(guān)系，然后導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建木瓜作用靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

木瓜化合物潛在靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖2。

圖2 木瓜化合物潛在靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖

由圖2可知。網(wǎng)絡(luò)共包括176個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中ENOX2，DIO1，DCAF5找不到與之相互作用的靶點(diǎn)蛋白。網(wǎng)絡(luò)共3051條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為34.7，圖中節(jié)點(diǎn)越大表明其度值越大，其中Degree值排在前20的關(guān)鍵蛋白分別為AKT1，VEGFA，MYC，IL6，TNF，ESR1， MMP9， JUN， IL10， PTGS2， CDKN2A，HIF1A，RELA，PTEN，CASP3，SPP1，AR，CDKN1A，F(xiàn)OS，CXCL8，表明這些蛋白在網(wǎng)絡(luò)中中心度較高，能與更多的蛋白發(fā)生互作，是木瓜作用的主要靶標(biāo)。

2.4 靶點(diǎn)GO富集分析和KEGG通路分析

為進(jìn)一步闡明木瓜化學(xué)分子的作用機(jī)制，將預(yù)測(cè)到的179個(gè)靶點(diǎn)蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。結(jié)果表明，其主要作用于TNF信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、甲型流感（Influenza A）、結(jié)核（Tuberculosis）、恰加斯病（Chagas disease）、弓形體?。═oxoplasmosis）、Toll樣受體信號(hào)通路（Toll-like receptor signaling pathway） 等。

木瓜靶點(diǎn)-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖3。

圖3 木瓜靶點(diǎn)-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)圖

靶點(diǎn)蛋白GO富集分析見(jiàn)圖4。

圖4 靶點(diǎn)蛋白GO富集分析

從分子功能（Molecular function）、細(xì)胞組成（Cellular component）和生物過(guò)程（Biological process）3個(gè)部分了解這些靶點(diǎn)蛋白GO生物學(xué)過(guò)程。其中分子功能主要集中在Binding（GO:0005488），Protein binding（GO:0005515），Ion binding（GO:0043167），Catalytic activity（GO:0003824），Organic cyclic compound binding（GO:0097159） 等；細(xì)胞組成上，與cell（GO:0005623），cell part（GO:0044464），intracellular（ GO:0005622） ， intracellular part（ GO:0044424），organelle（GO:0043226） 等相關(guān)性較大；此外，這些靶點(diǎn)主要參與了cellular process（GO:0009987），biological regulation （GO:0065007），response to stimulus（GO:0050896），regulation of biological process（GO:0050789） 等生物過(guò)程。

2.5 主要靶點(diǎn)AKT1與槲皮素分子對(duì)接

選取木瓜作用靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果中，Degree值最高的靶點(diǎn) AKT1，利用 http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/網(wǎng)站對(duì)AKT1三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬。利用在線生物信息學(xué)網(wǎng)站http://services.mbi.ucla.edu/SAVES/，對(duì)AKT1三維結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。Ramachandran plot分析證明模擬的AKT1三維結(jié)構(gòu)合理，可以用于下一步分子對(duì)接。AKT1為木瓜活性成分槲皮素的潛在靶標(biāo)，在ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)（http://zinc.docking.org/）中下載木瓜槲皮素（Quercetin：ZINC3869685） 分子的sdf文件，利用Autodock軟件進(jìn)行AKT1與槲皮素的對(duì)接研究。

木瓜槲皮素（Quercetin）與AKT1靶點(diǎn)蛋白分子對(duì)接圖見(jiàn)圖5。

圖5 木瓜槲皮素（Quercetin）與AKT1靶點(diǎn)蛋白分子對(duì)接圖

槲皮素可強(qiáng)有力作用于AKT1蛋白氨基酸殘基形成的疏水性口袋附近，能夠與AKT1蛋白以下位點(diǎn)以氫鍵方式結(jié)合：15位精氨酸、16位甘氨酸、18位酪氨酸、54位天冬氨酸、80位色氨酸、82位蘇氨酸、85位谷氨酸、87位蘇氨酸、187位絲氨酸、211位蘇氨酸、271位纈氨酸、274位天冬氨酸、295位亮氨酸和297位賴氨酸，這些結(jié)果一定程度上支持了前述預(yù)測(cè)的化合物和靶點(diǎn)分子互作的可靠性。

3 結(jié)論

木瓜在我國(guó)種植歷史悠久，栽培面積廣，分布于我國(guó)華中、華東、西南等地。其藥用價(jià)值也從古沿用至今，《本草綱目》即有“木瓜所主霍亂吐利轉(zhuǎn)筋、腳氣，皆脾胃病，非肝病也”的相關(guān)記載。但木瓜確切的藥理功能和作用機(jī)制尚缺乏深入研究。研究充分利用現(xiàn)有化合物及相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)木瓜主要活性成分及其靶點(diǎn)進(jìn)行分析研究，通過(guò)構(gòu)建木瓜分子化合物-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)，對(duì)木瓜相關(guān)靶點(diǎn)分子功能、細(xì)胞組成、生物過(guò)程和KEGG通路進(jìn)行富集分析，最后通過(guò)分子模擬及分子對(duì)接進(jìn)一步驗(yàn)證了化合物和靶點(diǎn)分子互作的可靠性。研究揭示了木瓜多化合物、多靶點(diǎn)的生物學(xué)特點(diǎn)，為從分子水平研究木瓜作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，也為整體上把握食品的功能活性研究提供一種新思路。