孫德春 王超 高磊 孫健 李志才 李曉文 李盛鈺

1.中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，江蘇蘇州 215163；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，吉林長春 130033；3.長春先盈醫(yī)療科技有限公司，吉林長春 130103

衰老是機(jī)體各器官、組織隨著年齡的增長而發(fā)生退行性變化的過程[1]?，F(xiàn)代研究認(rèn)為：衰老也是一種疾病，是可以被治療和預(yù)防的。目前已有很多抗衰老或延緩衰老的藥物或新成分得以開發(fā)研究[2-6]?？顾ダ厢t(yī)療器械也在研發(fā)中。

量子降脂儀釋放的量子能量被人體選擇性吸收，發(fā)生生物刺激作用，能利用人體血脂代謝的固有途徑，矯正血脂代謝紊亂，起到治療血脂異常的作用，且不會對機(jī)體造成損傷[7]。由于人體衰老存在不同程度的代謝紊亂、血脂、血黏度增高、脂褐素沉積等病理生理變化[8-9]，那么量子降脂儀在有效矯正人體血脂代謝紊亂的同時是否對人體具有一定的抗衰老和延緩衰老作用，值得深入研究。本研究以自然衰老小鼠為研究對象，給予相同量子強(qiáng)度不同治療時間，觀察量子降脂儀對模型動物學(xué)習(xí)記憶能力及抗氧化能力的影響，為量子降脂儀抗衰老作用積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

20只SPF級昆明種雌性小鼠，6周齡，體重18～22 g；80只SPF級昆明種雌性小鼠，11月齡，體重40～50 g，均購自長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(吉)-2011-0004。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

量子降脂儀（吉食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第2260103號），長春先盈醫(yī)療科技有限公司；跳臺儀（ZH-800S），安徽正華生物儀器有限公司；Morris水迷宮（Morris），安徽正華生物儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理方法 20只SPF級昆明種雌性小鼠，6周齡，用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，作為對照組，從試驗(yàn)第1周開始至第5周結(jié)束采用普通飼料飼喂，自由攝食，自由飲用蒸餾水。

80只SPF級昆明種雌性小鼠，11月齡，用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成4組，即模型組、陽性組、低強(qiáng)度組、高強(qiáng)度組，每組20只，從試驗(yàn)第1周開始至第5周結(jié)束均采用普通飼料飼喂，自由攝食，自由飲用蒸餾水。陽性治療組于第1周至第2周每天灌胃一次維生素E 40 mg/kg，第3周休養(yǎng)一周，第4周至第5周繼續(xù)每天灌胃一次維生素E 40 mg/kg。高強(qiáng)度治療組和低強(qiáng)度治療組采用量子降脂儀進(jìn)行治療，強(qiáng)度功率輸出為65 uw/cm2。低強(qiáng)度治療組于第1周至第2周每天治療1次，每次治療5 min；第3周休養(yǎng)一周；第4周至第5周繼續(xù)每天治療1次，每次治療5 min。高強(qiáng)度治療組于第1周至第2周每天治療2次，每次治療10 min；第3周休養(yǎng)一周；第4周至第5周繼續(xù)每天治療2次，每次治療10 min。

1.3.2 跳臺試驗(yàn) 末次治療后，各組小鼠進(jìn)行跳臺試驗(yàn)。將小鼠置于反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng)5 min，立即通以36V交流電，記錄小鼠第1次跳下平臺的時間（即潛伏期）及在5 min內(nèi)被電擊次數(shù)（即錯誤次數(shù)），以此作為學(xué)習(xí)成績。24 h后將小鼠直接置于跳臺上，重復(fù)測驗(yàn)，記錄小鼠第1次跳下平臺的時間及在5 min內(nèi)被電擊次數(shù)，以此作為記憶成績。

1.3.3 Morris水迷宮試驗(yàn) 末次治療后，各組小鼠進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)，連續(xù)進(jìn)行6天，前5天為定位航行實(shí)驗(yàn)，第6天為空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)：每天進(jìn)行4次訓(xùn)練，每次將小鼠面向池壁分別從不同的入水點(diǎn)放入水中，記錄小鼠從入水到找到水下隱藏平臺所需的時間（即逃避潛伏期）、平均游泳速度，90s內(nèi)停留在目的象限里的活動時間、游泳距離及游泳總路程。空間探索實(shí)驗(yàn)：撤去水中平臺，以水池中任一象限的一個位置作為入水點(diǎn)，讓小鼠在池內(nèi)游泳找尋平臺，記錄小鼠第一次通過平臺所需時間、通過平臺次數(shù)、平均游泳速度、90s內(nèi)停留在目的象限的時間和游泳距離以及游泳總路程。路程百分比及時間百分比計(jì)算公式如下：路程百分比=目標(biāo)象限游泳路程/總路程；時間百分比=目標(biāo)象限內(nèi)游泳時間/總時間。

1.3.4 血清及組織樣品的制備 Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后，小鼠禁食不禁水12 h，稱體質(zhì)量后摘取眼球取血，于4℃、3 000 r/min離心10 min，收集血清，置于-80℃冰箱備用。將取血后的小鼠頸椎脫臼處死，冰袋上迅速解剖取出小鼠肝臟、腎臟、脾臟、卵巢及腦組織，棉簽吸去浮血并稱其質(zhì)量，隨后將小鼠肝臟置于冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙吸干，用預(yù)冷生理鹽水制備1%和10%組織勻漿，于4℃、4 000 r/min離心10 min，取上清液，置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 臟器指數(shù)的測定 根據(jù)1.3.4方法中已記錄的小鼠稱體質(zhì)量及解剖后小鼠后各臟器質(zhì)量，按照以下公式計(jì)算小鼠臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)(mg/g)=臟器濕重(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)

1.3.6 血清及臟器組織中檢測指標(biāo)及檢測方法抗氧化指標(biāo)：分別檢測小鼠血清、肝臟組織中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPx）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）等的含量，及血清中端粒酶的含量。

性激素指標(biāo)：分別檢測小鼠血清中卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生長激素（luteinizing hormone，LH）的含量。

以上指標(biāo)的測定均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，各檢測指標(biāo)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均以均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力指標(biāo)比較

表1 各組小鼠跳臺試驗(yàn)記憶成績（±s）

表1 各組小鼠跳臺試驗(yàn)記憶成績（±s）

與模型組相比，* P＜0.05，** P＜0.01。

由表1可以看出，與模型組相比，陽性組、低強(qiáng)度組和高強(qiáng)度組均能延長小鼠第1次跳下平臺的時間，降低小鼠5 min內(nèi)的錯誤次數(shù)，且陽性組、高強(qiáng)度組小鼠的潛伏期組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明高強(qiáng)度量子降脂儀治療能提高自然衰老小鼠非空間性長期學(xué)習(xí)記憶的能力。

由表2可見，在定位航行試驗(yàn)中，與模型組相比，陽性組、低強(qiáng)度組和高強(qiáng)度組小鼠的逃避潛伏期明顯縮短，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），陽性組、高強(qiáng)度組小鼠的游泳平均速度提升，陽性組、低強(qiáng)度組和高強(qiáng)度組小鼠的路程百分比和時間百分比明顯增加，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 各組小鼠定位航行試驗(yàn)比較（±s）

表2 各組小鼠定位航行試驗(yàn)比較（±s）

與模型組相比，* P＜0.05，** P＜0.01。

表3 各組小鼠空間搜索試驗(yàn)比較（±s）

表3 各組小鼠空間搜索試驗(yàn)比較（±s）

與模型組相比，* P＜0.05，** P＜0.01。

由表3可見，在空間搜索試驗(yàn)中，與模型組相比，低強(qiáng)度組和高強(qiáng)度組小鼠的路程百分比和時間百分比均有提升，且高強(qiáng)度組小鼠的路程百分比和時間百分明顯高于模型組，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）?？梢娏孔咏抵瑑x對自然衰老小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力有所提高。

2.2 各組小鼠臟器指數(shù)及抗氧化指標(biāo)比較

表4 各組小鼠臟器指數(shù)比較（±s，mg/g）

表4 各組小鼠臟器指數(shù)比較（±s，mg/g）

與模型組相比，* P＜0.05，** P＜0.01。

由表4可知，與模型組相比，陽性組、低強(qiáng)度組和高強(qiáng)度組小鼠的臟器指數(shù)雖均有增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由表5和表6可知，與模型組相比，陽性組、低強(qiáng)度組和高強(qiáng)度組小鼠的血清和肝臟中的SOD、GSH-Px和CAT含量均有升高，MDA含量下降，高強(qiáng)度組和陽性組與模型組的差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表5 各組小鼠血清抗氧化指標(biāo)比較（±s）

表5 各組小鼠血清抗氧化指標(biāo)比較（±s）

與模型組相比，* P＜0.05，** P＜0.01。

表6 各組小鼠肝臟抗氧化指標(biāo)比較（±s）

表6 各組小鼠肝臟抗氧化指標(biāo)比較（±s）

與模型組相比，* P＜0.05，** P＜0.01。

2.3 各組小鼠血清中端粒酶含量及雌性激素比較

圖1 量子降脂儀對自然衰老小鼠血清中端粒酶濃度的影響

由圖1可知，與模型組相比，陽性組、低強(qiáng)度組和高強(qiáng)度組自然衰老小鼠血清中端粒酶濃度的含量有不同程度的升高，與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高強(qiáng)度組血清中端粒酶濃度的含量高于低強(qiáng)度組，接近陽性組，說明量子降脂儀能夠提高自然衰老小鼠端粒酶的含量，延長自然衰老小鼠的細(xì)胞壽命。

表7 各組小鼠血清中雌性激素指標(biāo)比較

由表7可知，各試驗(yàn)組與對照組相比，卵泡刺激素（FSH）和黃體生長激素（LH）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用自然衰老小鼠建立模型，以求最大程度接近衰老機(jī)體內(nèi)環(huán)境。腦部衰老的顯著表現(xiàn)就是學(xué)習(xí)能力的下降和記憶出現(xiàn)障礙，大量研究已經(jīng)證實(shí)人和動物的學(xué)習(xí)和記憶能力存在增齡性衰退現(xiàn)象[10-12]，尤其是空間參考記憶能力隨年齡增長呈減退趨勢[13]。所以采用跳臺試驗(yàn)和Morris水迷宮試驗(yàn)檢測小鼠長期學(xué)習(xí)記憶的能力。跳臺試驗(yàn)結(jié)果表明，模型組小鼠潛伏期明顯縮短，經(jīng)過量子降脂儀治療后潛伏期明顯延長且5 min內(nèi)出現(xiàn)的錯誤次數(shù)降低；Morris水迷宮小鼠在游泳訓(xùn)練中對于尋找安全平臺產(chǎn)生一定的學(xué)習(xí)和記憶能力，試驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠經(jīng)量子降脂儀治療后逃避潛伏期明顯縮短，說明量子降脂儀對學(xué)習(xí)和記憶能力嚴(yán)重受損的自然衰老的小鼠有一定的治療作用。

氧化損傷是細(xì)胞衰老的主流學(xué)說，自由基極易對細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸進(jìn)行侵害，形成脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[14]。SOD是機(jī)體內(nèi)清除自由基的重要物質(zhì)，在抗衰老研究中檢測SOD活性可作為判斷衰老程度的重要指標(biāo)[15-16]，其活性大小可以反映機(jī)體清除自由基能力[17]；GSH-Px可以催化還原性GSH與H2O2反應(yīng)生成對機(jī)體無害的水和氧化型GSH，有利于保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及功能的完整性[18]；CAT在生物機(jī)體內(nèi)普遍存，保護(hù)機(jī)體免受有害物質(zhì)損傷[19]；MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，可間接反映機(jī)體的氧化損傷程度[20]。本研究表明，高強(qiáng)度治療組的小鼠SOD、GSH-Px和CAT等抗氧化酶活性明顯提高，MDA等脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物減少，提示量子降脂儀能夠提高自然衰老小鼠清除自由基的能力，減少過氧化產(chǎn)物對機(jī)體的損傷，抑制脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而降低機(jī)體的老化程度，發(fā)揮其抗衰老作用。

端粒是存在于真核細(xì)胞染色體的末端特殊的一個結(jié)構(gòu)，其長度隨著細(xì)胞的不斷分裂而不斷縮短，當(dāng)其縮短到一定程度后，細(xì)胞則停止分裂即趨向衰老和死亡，所以端粒的長度決定了細(xì)胞的壽命[21]。而端粒酶則是一種核蛋白的逆轉(zhuǎn)錄酶，它的活性表達(dá)可以穩(wěn)定端粒長度防止其在復(fù)制中不斷縮短[22-23]，細(xì)胞壽命也就得以延長。本研究表明，量子降脂儀能夠提高自然衰老小鼠血清中端粒酶活性，延緩端?？s短可能是其抗衰老作用的機(jī)制之一，但由于端粒酶的激活受多因素影響[24-25]，故量子降脂儀對其活性的調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

機(jī)體的衰老程度也會反映在腦、胸腺、脾、肝、腎等臟器指數(shù)的變化上[26]。但本研究結(jié)果提示，量子降脂儀能夠增加自然衰老小鼠的臟器指數(shù)，但卻無顯著影響，說明在一定量子輸出功率范圍內(nèi)（65 uw/cm2），是不會對臟器質(zhì)量產(chǎn)生明顯影響的。

此外，由于以雌性小鼠為研究對象，故對小鼠血清中卵泡刺激素（FSH）、黃體生長激素（LH）的含量進(jìn)行測定研究，發(fā)現(xiàn)量子降脂儀不會對自然衰老小鼠的雌性激素產(chǎn)生影響，說明量子降脂儀是安全的。

綜上所述，量子降脂儀能夠提高自然衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力，及血清和肝臟中SOD、GSH-Px和CAT抗氧化酶活性，減少M(fèi)DA脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，抑制脂質(zhì)過氧化，降低機(jī)體的老化程度；并能夠提高自然衰老小鼠血清中端粒酶活性，延緩端?？s短，發(fā)揮其抗衰老作用，但不會對自然衰老小鼠的臟器及雌激素產(chǎn)生影響。