孫梅 劉鵬 耿建利 王曉偉 姚繼承 王明義

1.大連醫(yī)科大學附屬威海市立醫(yī)院中心實驗室，山東威海 264200；2.大連醫(yī)科大學附屬威海市立醫(yī)院肝膽外科，山東威海 264200；3.威海威高生物科技有限公司，山東威海 264200

化學發(fā)光免疫檢測法是目前檢測抗原、半抗原及抗體的主流方式，靈敏度、特異性高的特點使其可用于腫瘤標志物、激素等微量物質的超微定量及定性分析。因此，在各級醫(yī)療機構中全自動化學發(fā)光檢測儀應用普遍。實驗室對全自動化學發(fā)光檢測儀的臨床性能要求也不斷提高?；瘜W發(fā)光體系的設計與應用是發(fā)展化學發(fā)光技術的前提。國外對于化學發(fā)光體系的研究與應用已經(jīng)相當成熟，通過實現(xiàn)與高效液相 色譜、毛細管電泳、生化免疫分析、電化學分析等技術的聯(lián)合應用可解決化學發(fā)光分析固有選擇性差這一難題，使化學發(fā)光分析靈敏度更高、結果更準確。但我國國產儀器與國外同類產品在性能上還有一定差距，因此，提高核心科學技術的整體水平而推動國內自動化儀器的發(fā)展是必然趨勢。微粒子化學發(fā)光檢測體系作為化學發(fā)光檢測儀的重要模塊，其關鍵技術水平也在不斷優(yōu)化。本文以新一代國產免疫分析儀AutolumiS 3000的微粒子化學發(fā)光檢測體系為例，對微粒子化學發(fā)光檢測體系進行介紹。

化學發(fā)光試劑的研究應用及發(fā)展是推動化學發(fā)光分析技術進步的基礎。目前化學發(fā)光試劑的種類有很多，包括魯米諾類、吖啶酯類、過氧草酸酯類和1，2-二氧雜環(huán)丁烷類等，魯米諾類發(fā)光效率高、結構穩(wěn)定且無毒的特點使其成為化學發(fā)光試劑的代表性物質之一，在免疫分析或非免疫分析診斷、檢測技術和生物傳感器等領域有著廣泛的應用。

1 免疫復合物形成

魯米諾類是目前化學發(fā)光體系中應用最為廣泛的化學發(fā)光試劑。異魯米諾發(fā)光效率雖較魯米諾差，但異魯米諾做為一種標記物,被標記到抗原或抗體上時,它的發(fā)光效率則顯著增加。結合異魯米諾反應時間短、背景噪聲低、可直接標記抗原或抗體且結合穩(wěn)定的特點，AutolumiS 3000的微粒子化學發(fā)光檢測體系選用異魯米諾作為直接發(fā)光試劑。在免疫反應過程中，以抗原或抗體異魯米諾發(fā)光標記物為示蹤信號，以偶聯(lián)抗原或抗體的磁性微粒子為載體，增大反應表面積，與待測物在均相中反應，形成“夾心”免疫復合物。

2 免疫復合物無損磁性分離

2.1 微米級別的磁性微粒

AutolumiS 3000的微粒子化學發(fā)光檢測體系采用微米級別的Fe3O4核心的磁微粒為固相載體—磁性微粒表面積大，蛋白吸附能力極強，與包被管或包被珠相比反應表面積增大50倍，是目前最理想的免疫固相分離載體之一。磁微粒增進了結合動力并保證了較大的敏感度。分散懸浮液的反應速率接近均相溶液的動力學，同時抗原抗體的相對反應濃度增高，增快了捕捉的有效性，提高了精確度，加快了免疫反應的速度。

圖2 儀器洗滌區(qū)磁分離結構示意圖

2.2 磁場磁性分離技術

通過對復合物顆粒磁分離過程的分析，給出了磁場設計原則（按圖1從小到大依次為16S、15N、14S、13N…順序排列）。免疫復合物充分無損分離技術（磁場磁性分離技術）的分離共分為三個過程，即吸附過程、沖洗過程和吸走過程。磁鐵吸附住磁微粒，能更有效的將游離相和結合相分離。將未結合的抗原和標記物洗滌清除，實現(xiàn)了免疫復合物顆?？焖俪浞譄o損分離。

AutolumiS 3000儀器磁分離模塊結構示意圖（如圖2）。磁場作用原理：反應杯中的免疫復合物所處的環(huán)境可以視為磁流體，在外加磁場的作用下，液體中的免疫復合物被磁化靠近永磁體，吸附在反應杯壁上，而未與發(fā)光標記物結合的顆粒則仍然在反應杯中間位置通過沖洗過程和吸走過程，只留下結合的免疫復合物，從而實現(xiàn)復合物顆粒磁分離過程。

磁場的作用是將復合顆粒束縛在反應杯中，但是又不能使復合物聚集結團，為避免這一情況發(fā)生采用圓形的磁鐵。在磁分離過程中，外加磁場位于反應器皿的側面吸附前復合物顆粒均勻分散在反應杯中，吸附后附著在反應杯的側壁，反應杯吸附過程如圖3所示。

圖3 反應杯吸附過程示意圖

3 異魯米諾化學發(fā)光

異魯米諾化學發(fā)光已經(jīng)廣泛應用于環(huán)境、醫(yī)藥、生命科學等領域中有機物及無機物的檢測。其發(fā)光機理是在堿性環(huán)境中下，異魯米諾被氧化劑H2O2氧化而處于激發(fā)態(tài)，當其返回到基態(tài)過程中發(fā)出光子，從而獲得閃光信號，如圖4所示。為保證反應充分徹底，使測量結果準確可靠，必須實現(xiàn)全部復合物顆粒與激發(fā)液的充分接觸。因此，通過直針與彎針形式的洗滌針（如圖5所示），在激發(fā)液加注前的洗滌過程中通過直針將反應杯底部的復合物顆粒團沖開，彎針將貼附在杯壁上的復合物顆粒沖下，防止復合物顆粒聚集成團，保證未結合顆粒全部吸走。

圖4 異魯米諾化學發(fā)光原理圖

圖5 洗滌針中直針、彎針設計

4 微弱閃光信號精確測量

為實現(xiàn)信號的精確測量，研制出微弱閃光信號精確測量技術系統(tǒng)，AutolumiS 3000測量室結構如圖6所示。該系統(tǒng)設有嚴格避光的暗室環(huán)境（如圖7所示）。反應杯進入反應杯通道，傳送到反應杯第一孔加注激發(fā)液位置，擋光板關閉，通過測量室升降動作，控制玻璃關門打開，加注激發(fā)液并測量反應杯第一孔。然后玻璃關門關閉，傳到第二孔加注激發(fā)液位置，依次進行。暗室采用背膠毛氈等材料實現(xiàn)加注針移動過程中的動密封，同時采用交替遮擋方法實現(xiàn)測量室的光密封，能有效去除背景光反射，降低本底噪聲，使測量更精準?；瘜W反應所產生的閃光信號通過集光器接收，并在光電倍增管作用下實現(xiàn)信號的放大，通過上位機處理程序分析所得RLU值（relative light unit），獲得樣本濃度信息，實現(xiàn)待測物的定量或定性分析。

圖6 發(fā)光檢測系統(tǒng)測量室結構圖

圖7 測量室暗室環(huán)境示意圖

5 小結

AutolumiS 3000微粒子化學發(fā)光體系采用異魯米諾為化學發(fā)光劑，可通過反應中化合物能量的躍遷產生光量子而獲得樣本的濃度信息，不需要增加外部光源，從而減少了瑞利散射和拉曼散射，背景光信號干擾小，使測量結果更加精準。在免疫反應中采用磁性微粒為載體，與包被管、包被珠相比，反應表面積增大了50倍，可大幅度縮短檢測時間，且在磁場作用下可有效實現(xiàn)結合相與游離相的充分無損分離?？朔藗鹘y(tǒng)酶免疫方法反應時間長、操作繁瑣、靈敏度低等缺點。該體系中還設有微弱閃光信號檢測系統(tǒng)，在完全密閉的暗室中完成化學發(fā)光反應及閃光信號的收集，消除背景光干擾，從而實現(xiàn)待測物濃度信息準確分析。