何美玲，楊喆，戴研平，雷珊，高曉勤

(1.貴州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院，貴州 貴陽 550004；2.遵義醫(yī)藥高等專科學校，貴州 遵義 563006)

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是人類消化道的惡性腫瘤之一，其病情進展迅速易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移和產(chǎn)生化學抗性，通?；颊叽_診時已為晚期[1-2]。對PC治療有手術切除、化學療法和放射療法等多種手段，但患者5年生存率仍低于5%[2-3]。因此，詳細了解PC發(fā)病的分子機制，對尋找新的PC生物標志物和治療策略的發(fā)展具有重要的意義。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, LncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的不編碼蛋白質(zhì)的 RNA，在多種細胞病理生理過程中起著至關重要的作用，如增殖、凋亡、去分化、周期阻滯、侵襲和遷移等[4-5]。LncRNA異常表達的現(xiàn)象在各種腫瘤中均有發(fā)現(xiàn)，提示lncRNA可能是潛在的致癌或抑癌的RNA[6-9]。Linc00152是一種定位于2號染色體(2p11.2)的LncRNA[10]，研究表明其在多種類型的癌癥中參與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[11-14]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Linc00152在胰腺癌組織和細胞系中均高表達，影響胰腺癌患者的生存預后，但Linc00152在胰腺癌中的相關功能及影響尚不清楚。本研究通過干擾胰腺癌細胞株MIA PaCa-2和SW1990中Linc00152的表達，研究Linc00152對胰腺癌細胞增殖能力的影響，為尋找胰腺癌潛在的治療靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

胰腺癌細胞株MIA PaCa-2和SW1990購自美國ATCC細胞庫，胎牛血清(FBS)、轉(zhuǎn)染用OPTI-MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，RT試劑盒、PCR相關SYBRP、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自鼎國生物有限公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所，細胞周期試劑盒購自美國Thermo公司，兔抗人單克隆抗體細胞周期蛋白D1(cyclinD1)、細胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)以及鼠抗人GAPDH單克隆抗體均購自武漢賽威爾生物技術有限公司，Lipofectamine 2000和相關轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司，Linc00152的下調(diào)siRNA序列TAGGCGATACGATGCTTTA-3′、陰性對照(NC)序列TAATCGCTACGATGCACTA-3′及RT-qPCR相關的Linc00152和GAPDH上游、下游引物均由上海生工生物技術有限公司設計合成，Linc00152上游引物5′-AAAATCACGACTCAGCCCCC-3′、下游引物5′-AATGGGAAACCGACCAGACC-3′，GAPDH上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′、下游引物 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人胰腺癌細胞MIA PaCa-2和SW1990分別培養(yǎng)在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，均放置于在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；根據(jù)Lipofectamine 2000操作說明轉(zhuǎn)染NC及Si-Linc00152序列，實驗分為陰性對照組(NC組)和Linc00152干擾組(Si-Linc00152組)，細胞轉(zhuǎn)染48 h后, 進行后續(xù)實驗。

1.2.2實時熒時聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)驗證Linc00152的干擾效率 收集各組轉(zhuǎn)染48 h后的細胞，在TRIzol 試劑，離心、萃取，加異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌，DEPC水溶解，測RNA純度和濃度。取總RNA 1 000 ng配制RT反應液，Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應。按說明書配好PCR反應液后，瞬時離心，上實時熒光定量PCR儀擴增Linc00152以及內(nèi)參基因GAPDH，通過2-(ΔΔCT)法計算Linc00152的相對表達量。

1.2.3CCK-8實驗檢測細胞增殖 轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化各組細胞株，終止消化并重懸細胞，以每孔1×103個細胞，接種到96孔培養(yǎng)板中；于6、24、48、72和96 h時，將 CCK-8的溶液加入每個孔中，在37 ℃下孵育2 h；取出96孔培養(yǎng)板上酶標儀，在450 nm處檢測CCK-8的吸光度，根據(jù)吸光度描繪曲線。

1.2.4平板克隆細胞集落形成實驗 轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化各組對數(shù)生長期的細胞株，用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸，分別接種到6 cm培養(yǎng)皿中，調(diào)整密度為每皿1 200個。然后在5% CO2培養(yǎng)箱中于37 ℃溫育8 d，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次后，用4%多聚甲醛固定30 min后，倒掉甲醛，加入結(jié)晶紫染液染色30 min，倒掉結(jié)晶紫液，純水清洗、拍照，并計數(shù)染色的集落形成數(shù)目。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞周期 分別將轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞株接種于6孔板培養(yǎng)72 h，胰酶消化，調(diào)整細胞密度1×107個/L，70%乙醇-20 ℃固定過夜后，離心棄上清，加PBS洗凈重懸，加入RNA酶、碘化丙啶在37 ℃下避光放置30 min，最后上流式細胞儀檢測細胞周期。用CellQuest 軟件、ModFit 軟件分析實驗結(jié)果，統(tǒng)計學方法分析各組細胞周期的分布。

1.2.6Western blot檢測細胞周期相關蛋白cyclinD1及CDK4表達 取出轉(zhuǎn)染48 h后的各組PC細胞株，加RIPA蛋白裂解液，低溫離心，提取總蛋白，加入BCA顯色劑，制作標準曲線。蛋白變性10 min，按配方配制SDS-PAGE膠，電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，室溫封閉2 h，加一抗4 ℃孵育過夜；次日加二抗于搖床上室溫孵育2 h。上曝光機，加ECL化學發(fā)光混合液，曝光顯影，Image J軟件用于分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值，統(tǒng)計圖分析蛋白表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率及干擾效率

利用siRNA構(gòu)建干擾模型 48 h，與NC組比較, Si-Linc00152組的Linc00152表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。

注：(1)與NC組比較，P<0.01。圖1 轉(zhuǎn)染后胰腺癌細胞Linc00152相對表達量Fig.1 The relative expression of Linc00152 after transfection

2.2 干擾Linc00152后胰腺癌細胞增殖能力受到抑制

通過轉(zhuǎn)染Si-Linc00152干擾Linc00152的表達，結(jié)果顯示，在72和96 h兩個時間節(jié)點，Si-Linc00152組較NC組的增殖能力顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖2。

注：A為MIA PaCa-2，B為SW1990；(1)與NC組比較，P<0.01。圖2 干擾Linc00152表達對胰腺癌細胞增殖能力的影響 (CCK8法)Fig.2 Effect of knockdown Linc00152 on the cell proliferation of pancreatic cancer cells by CCK8 assay

2.3 干擾Linc00152后胰腺癌細胞克隆形成能力受到抑制

收集經(jīng)轉(zhuǎn)染48 h后的各組胰腺癌細胞，細胞在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)8 d后，NC組MIA PaCa-2集落形成的數(shù)量為(548.3±11.6)個、Si-Linc00152組為(245.0±9.8)個，NC組SW1990集落形成的數(shù)量為(562.3±14.1)個、Si-Linc00152組為(306.0±8.4)個，Si-Linc00152組均較NC組的細胞集落形成數(shù)目明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖3。

2.4 干擾Linc00152可以阻滯胰腺癌細胞周期于G0/G1期

與NC組比較，Si-Linc00152組在細胞周期中的G1期細胞所占百分比上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖4。提示干擾Linc00152可誘導胰腺癌細胞在G0/G1期細胞周期阻滯。

注：A為平板克隆實驗，B為細胞集落形成數(shù)；(1)與NC組比較，P<0.01。圖3 干擾Linc00152表達對胰腺癌細胞增殖的影響(克隆形成實驗)Fig.3 Effect of knockdown Linc00152 on the cell proliferation of pancreatic cancer cells by colony formation assay

注：A～D為流式細胞圖，E、F為直條圖，A、B、E為MIA PaCa-2，C、D、F為SW1990，A、C為NC組，B、D為Si-Linc00152組；(1)與NC組比較，P<0.01。圖4 干擾Linc00152表達后對細胞周期的影響 (流式細胞術) Fig.4 Effect of knockdown Linc00152 on cell cycle of pancreatic cancer cells by FCM

2.5 干擾Linc00152表達后cyclinD1和CDK4蛋白表達

Western blot檢測轉(zhuǎn)染48 h時MIA PaCa-2和SW1990細胞蛋白表達水平變化,實驗顯示，與NC組比較，Si-Linc00152組的細胞周期相關蛋白cyclinD1及CDK4的表達均減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖5。提示干擾Linc00152抑制了胰腺癌細胞株的增殖能力，誘導細胞在細胞周期G0/G1期停滯，可能與細胞周期相關蛋白cyclinD1及CDK4的表達減少有關。

注：A為Western blot結(jié)果，B、C分別為MIA PaCa-2、SW1990條圖；(1)與NC組比較，P<0.01。圖5 干擾Linc00152表達后對胰腺癌細胞中CyclinD1及CDK4蛋白表達的影響Fig.5 The expression of CyclinD1and CDK4 proteins after knocking down Linc00152

3 討論

LncRNA已成為基因表達的關鍵調(diào)節(jié)因子，并在各種癌癥的發(fā)生和進展中發(fā)揮關鍵作用[15]。Linc00152(長基因間非編碼RNA 152)，是一類與癌癥相關的828 bp的lncRNA，定位于2號染色體短臂(2p11.2)[16]。有研究表明，Linc00152的高表達與腫瘤進展、淋巴結(jié)侵襲和TNM分期進展呈正相關[17]，并且在體外和體內(nèi)促進腫瘤進展[18]。盡管Linc00152逐步被證實為多種人類惡性腫瘤形成的重要的基因表達調(diào)控器，但是其與胰腺癌的關系卻尚不清楚。在本實驗室前期研究中，發(fā)現(xiàn)在Linc00152胰腺癌細胞株和組織中均高表達，且與生存預后密切相關。本研究中，CCK8實驗結(jié)果顯示干擾Linc00152表達后胰腺癌細胞的增殖能力明顯降低；平板克隆實驗結(jié)果表明，沉默Linc00152后胰腺癌細胞克隆數(shù)目顯著降低；結(jié)果表明干擾Linc00152的表達可抑制MIA PaCa-2和S1990細胞的增殖能力。細胞周期主要由細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)驅(qū)動，CDK通過在不同細胞周期階段與細胞周期蛋白(cyclin)結(jié)合形成特異性復合物而被激活，并促進細胞通過G1/S期調(diào)控點進入S期進行DNA復制，因此促進細胞增殖，異常調(diào)節(jié)的CDK會誘導細胞不定期增殖[19]。流式細胞術實驗表明，沉默Linc00152的表達后G1期MIA PaCa-2和S1990細胞增多，發(fā)生細胞周期阻滯；沉默Linc00152后cyclinD1和CDK4的表達下調(diào)，而cyclinD1和CDK4是細胞周期G1 向S期轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)劑，因此干擾Linc00152能延長G1期的持續(xù)時間，阻礙G0/G1到S期的轉(zhuǎn)變，導致細胞在細胞周期G0/G1期停滯，抑制了細胞的增殖。

綜上所述，本研究證實干擾Linc00152在體外能抑制胰腺癌細胞株的增殖，顯示了Linc00152在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的調(diào)控作用，為胰腺癌的分子靶向治療提供了思路和依據(jù)。目前對Linc00152的機制研究仍然不完整，其具體的作用途徑及分子生物學機制尚未明確，還需要進一步的探索及研究。