林曉堅(jiān)，袁兆偉，潘彩燕，孫黔云，宛蕾**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550025；2.貴州省中國(guó)科學(xué)院 天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550014)

血小板在生理性止血過程中發(fā)揮著重要作用，當(dāng)血管受到某些刺激造成血管損傷而出血時(shí)，損傷部位的激活因素即可刺激血小板，使其發(fā)生聚集、黏附成為凝塊，產(chǎn)生初級(jí)止血的作用，隨后血小板經(jīng)過一系列的反應(yīng)，直到血塊回縮產(chǎn)生穩(wěn)定的血栓[1-2]。臨床實(shí)踐表明，中藥及其制劑對(duì)于抗血小板、抗血栓具有良好的效果，在治療心血管疾病方面具有療效可靠，副作用小等優(yōu)勢(shì)[3]。紅景天是大花紅景天(rhodiolaroseaL.)的干燥根和根莖，據(jù)藥典記載，紅景天具有益氣活血、通脈平喘的功效，可用于治療氣虛血瘀、胸痹心痛、中風(fēng)偏癱及倦怠氣喘等[4]。紅景天苷(salidroside，Sal)是紅景天的主要有效成分[5]，現(xiàn)代藥理研究表明Sal具有保護(hù)心肌缺血-再灌注損傷[6]、緩解動(dòng)脈粥樣硬化[7]、抗腫瘤[8]、保護(hù)腎臟[9-10]、保護(hù)肝臟[11-12]及抗衰老[13]等多種藥理作用，但對(duì)Sal的抗血栓作用研究較少。因此，本研究采用血塊回縮實(shí)驗(yàn)，觀察Sal體外抗血栓作用，并對(duì)血小板血栓素B2(thromboxane B2，TXB2)水平進(jìn)行檢測(cè)，為進(jìn)一步開發(fā)Sal提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明小鼠，20只，體質(zhì)量25～30 g，雌雄各半，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(黔)2018-0001。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。

1.1.2主要藥物及試劑 Sal購(gòu)自上海瓦蘭生物科技有限公司(批號(hào)HJT20180812，純度≥98%)，凝血酶(批號(hào)SLBV2136)、纖維蛋白原(批號(hào)SLBS4238)和前列腺素 E1(prostaglandin E1，PGE1，批號(hào)BCBQ3312V)均購(gòu)自Sigma公司，鹽酸替羅非班氯化鈉注射液(批號(hào)171201)購(gòu)自遠(yuǎn)大醫(yī)藥中國(guó)有限公司，裂解液(批號(hào)20180913)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒(批號(hào)20190327)購(gòu)自南京建成生物工程研究所，TXB2試劑盒(批號(hào)201903)購(gòu)自上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司。

1.1.3儀器 BC-5130型全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，5810R型高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，移液器購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，XS205型萬分之一電子天平購(gòu)自瑞士梅特勒-托利多科學(xué)儀器公司產(chǎn)品，RP6002K型電子天平購(gòu)自常州銳品精密儀器有限公司，ELx800-MV酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)柏騰儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1制備小鼠洗滌血小板 實(shí)驗(yàn)前小鼠正常給予飼料和飲水，不給予藥物干預(yù)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將小鼠麻醉(4%水合氯醛、400 mg/kg)固定后，以3.8%枸櫞酸鈉抗凝(抗凝劑與所取血液體積之比為1 ∶9)下腔靜脈取血，置于10 mL離心管內(nèi)，加入1×Tyrode Buffer(NaCl 137 mmol/L、 NaHCO313.8 mmol/L、KCl 2.5 mmol/L、NaH2PO40.36 mmol/L、HEPES 20 mmol/L、葡萄糖5.5 mmol/L)等體積稀釋，同時(shí)加入終濃度為50 μg/L的PGE1；220×g 離心20 min，吸取上層富含血小板液體，轉(zhuǎn)移至另一離心管(10 mL)，加入終濃度50 μg/L PGE1和1 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)；2 000 r/min離心10 min，棄去上清液，離心管底部為血小板團(tuán)塊；加入適量1×Tyrode Buffer重懸血小板，并加入終濃度50 μg/L PGE1；2 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入適量1×Tyrode Buffer重懸血小板；血細(xì)胞分析儀檢測(cè)血小板數(shù)目，用1×Tyrode Buffer調(diào)整血小板數(shù)目至2×1011個(gè)/L，室溫靜置30 min備用。

1.2.2LDH法檢測(cè)Sal對(duì)血小板的毒性作用 將制備的洗滌血小板分為7組，即空白對(duì)照組(生理鹽水)、Sal(12.5、25.0、50.0、100.0及200.0 μmol/L)5個(gè)劑量組(Sal為生理鹽水配制)和裂解液裂解組。將血小板按照分組給予不同處理孵育1 h后，參照文獻(xiàn)[14]制取待測(cè)樣品，使用LDH試劑盒檢測(cè)各組LDH含量，并計(jì)算LDH的相對(duì)釋放量(%)=[給藥組LDH(U/L)/裂解液裂解組LDH(U/L)]×100%。

1.2.3血塊回縮的檢測(cè) 將制備的洗滌血小板分裝到2 mL離心管中，每管500 μL，分為空白對(duì)照組(5 μL生理鹽水)、模型組(5 μL生理鹽水)、陽性對(duì)照組(5 μL替羅非班，終濃度為0.5 mg/L)，Sal低劑量組(終濃度25 μmol/L)及Sal高劑量組(終濃度50 μmol/L)，與藥物混勻后室溫孵育10 min；各管加入CaCl25 μL和纖維蛋白原10 μL，使Ca2+終濃度為1 mmol/L，纖維蛋白原終濃度為400 mg/L，手指輕輕彈動(dòng)，使其均勻混合；除空白對(duì)照組外，其余各管加入現(xiàn)配的20 000 U/L凝血酶5 μL，使其終濃度為200 U/L，上下輕輕顛倒幾次使其混勻，37 ℃水浴放置，30 min時(shí)進(jìn)行觀察和拍照，用Image J法計(jì)算血塊比率(%)=(血塊面積/血塊回縮前面積)×100%[15]。

1.2.4ELISA法檢測(cè)血小板中TXB2的含量 分組同1.2.3，在洗滌血小板中加入不同處理孵育5 min后，加入CaCl2，使Ca2+終濃度為1 mmol/L，隨后加入凝血酶(終濃度2.5×10-5U/L)聚集5 min，加入2×終止液(6 mmol/L阿司匹林，20 mmol/L EDTA)停止反應(yīng)，并于冰上靜置8 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min[16]；取上清保存于-20 ℃，樣品用TXB2試劑盒檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血小板LDH活性

血小板孵育1 h后，與空白對(duì)照組相比，裂解液裂解組小鼠洗滌血小板LDH活性明顯較高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但其余各組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與裂解液裂解組相比，Sal各劑量組小鼠洗滌血小板LDH活性均明顯較低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但Sal各劑量組LDH活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠洗滌血小板LDH活性及相對(duì)釋放量Tab.1 The effects of Sal on the LDH release of washed platelets in mice

注：(1)與空白對(duì)照組相比，P<0.01；(2)與裂解液裂解組相比，P<0.01。

2.2 血小板血塊回縮

水浴靜置30 min后，空白對(duì)照組小鼠洗滌血小板未發(fā)生血塊回縮；與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠洗滌血小板中凝血酶能引起明顯的血塊回縮，血塊比率顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；陽性對(duì)照組小鼠洗滌血小板中血塊回縮受到顯著抑制，血塊比率顯著大于模型組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Sal低、高劑量組小鼠洗滌血小板均可抑制凝血酶誘導(dǎo)的血塊回縮，血塊比率大于模型組(P<0.05或P<0.01)。見圖1、表2。

注：A為空白對(duì)照組，B為模型組，C為替羅非班組，D為 Sal低劑量組，E為Sal高劑量組。圖1 各組小鼠洗滌血小板的血塊回縮比較Fig.1 Comparison of clot retraction of washed platelets in mice of each group

表2 各組小鼠洗滌血小板血塊回縮實(shí)驗(yàn)中血塊比例Tab.2 Comparison of clot ratio of washed platelets in mice of each group

注：(1)與空白對(duì)照組比較，P<0.01；與模型組比較，(2)P<0.05，(3)P<0.01。

2.3 血小板TXB2含量

與空白對(duì)照組相比，模型組洗滌血小板TXB2含量水平明顯增大，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，Sal低、高劑量組和陽性對(duì)照組小鼠洗滌血小板TXB2均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠洗滌血小板TXB2含量Tab.3 The effect Sal on the content of platelet TXB2

注：(1)與空白對(duì)照組比較，P<0.01；(2)與模型組比較，P<0.05。

3 討論

血小板又稱血栓細(xì)胞，是源自骨髓巨核細(xì)胞的小片細(xì)胞質(zhì)，無細(xì)胞核有細(xì)胞質(zhì)，是最小的血細(xì)胞，其主要功能為凝血和止血[17]。LDH是一種糖酵解酶，存在于機(jī)體所有組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，是能催化乳酸脫氫生成丙酮酸的酶，細(xì)胞受損時(shí)，受損細(xì)胞釋放LDH[16]；血小板釋放的LDH增加，血小板質(zhì)量下降，影響血小板功能[18]。LDH釋放量反映藥物對(duì)血小板的毒性，其釋放量大則表明對(duì)血小板產(chǎn)生損傷?？瞻讓?duì)照組血小板在靜置1 h后有LDH釋放到胞外，但釋放量明顯低于LDH釋放較完全的裂解液裂解組(P<0.01)，Sal低、高劑量孵育血小板后，血小板的LDH釋放量較少，相較于空白對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但明顯低于裂解液裂解組(P<0.01)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Sal各劑量組對(duì)血小板LDH的釋放量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示Sal對(duì)血小板無明顯毒性反應(yīng)。血小板在纖維蛋白索上的黏著，如果血小板偽足發(fā)生收縮，被黏著的纖維蛋白索之間角度顯著縮小，進(jìn)而引起整個(gè)血塊的收縮[19]。血小板介導(dǎo)的血塊回縮有利于傷口的閉合，保證止血，促使形成更加穩(wěn)定的栓塊[20]。當(dāng)機(jī)體的血小板出現(xiàn)功能受損或者計(jì)數(shù)過低等情況時(shí)，則血塊回縮亦受到影響[19]。本研究在相同血小板計(jì)數(shù)并排除藥物毒性后，進(jìn)行了血塊回縮實(shí)驗(yàn)。在37 ℃水浴30 min后，空白對(duì)照組未發(fā)生血塊回縮，加了凝血酶刺激的模型組發(fā)生了明顯的血塊回縮，血塊比率顯著低于空白對(duì)照組(P<0.01)，陽性藥組、Sal低劑量組和Sal高劑量組血塊比率明顯大于模型組(P<0.05或P<0.01)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Sal對(duì)凝血酶刺激誘發(fā)的血塊回縮具有顯著抑制作用，這表明Sal在體外對(duì)血栓亦有抑制作用。

血小板質(zhì)膜上具有二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)受體、GP Ⅱb/Ⅲa受體以及凝血酶(thrombin)受體等多種受體存在，這些受體具有相應(yīng)的受體激動(dòng)劑并可被其激活[21-22]。血小板在正常脈管系統(tǒng)中處于靜息狀態(tài)[23]，如果血小板發(fā)生粘附或被激動(dòng)劑如ADP和凝血酶等激活，血小板隨即發(fā)生一系列的后續(xù)反應(yīng)，比如花生四烯酸(arachidonic acid，AA)的產(chǎn)生代謝，血栓素A2(Thromboxane A2,TXA2)、ADP等進(jìn)行釋放。血小板發(fā)生活化以后，AA生物轉(zhuǎn)化為TXA2，生成的TXA2與血栓素受體(thromboxane receptors，TP)相互作用有效地增強(qiáng)血小板活化[24-25]。血小板由于各種原因發(fā)生激活時(shí)，存在于表面的GP Ⅱb/ⅢIa受體發(fā)生形變，這種狀態(tài)下該受體具有高親和力，可以與配體相結(jié)合。任何刺激劑激活血小板均需通過GP Ⅱb/Ⅲa受體方可與鄰近血小板連接，因此GP Ⅱb/Ⅲa受體是血小板聚集和血栓形成的最終共同通路[26]。本研究選擇的陽性藥為替羅非班，這是一種GP Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑，結(jié)果表明在凝血酶刺激下，模型組TXB2含量明顯升高(P<0.01)，相較之下，血小板經(jīng)Sal孵育后再由凝血酶刺激，其生成的TXB2顯著減少(P<0.05)。由于機(jī)體內(nèi)TXA2可在很短的時(shí)間內(nèi)降解為TXB2，因此實(shí)驗(yàn)中只能通過檢測(cè)TXB2含量來間接反映TXA2含量，Elisa法檢測(cè)結(jié)果表明Sal可以減少洗滌血小板的TXB2含量，提示Sal的抗血栓作用可能是通過減少TXA2實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，Sal對(duì)血小板無明顯毒性，可以明顯抑制凝血酶誘導(dǎo)的血塊回縮，此過程可能是通過減少血小板TXA2的含量發(fā)揮作用的。