毛彥穩(wěn)，張小歡，劉玲伶，劉慧銘，梁露群，張會芳，向珈誼，王圓圓

(貴州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 病理生理教研室，貴州省常見慢性疾病發(fā)病機制及藥物研究重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)最常見的嚴重微血管并發(fā)癥之一[1]。在DN過程中，上皮細胞表型標志物(例如E-cadherin、N-cadherin等)表達減少，并逐漸表達間質細胞表面標志物(Desmin、α-Smooth muscle actin等)，發(fā)生向成纖維細胞轉分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，從而加重加快DN腎臟纖維化的進程[2-4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細胞EMT在腎纖維化中發(fā)揮重要作用，抑制上皮細胞轉分化將抑制或延緩DM腎臟纖維化以及高糖誘導的腎小管上皮細胞纖維化進程[5-8]。轉化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1, TGF-β1)可以誘導EMT的發(fā)生，是公認的致纖維化因子[9-11]。Smad3 作為TGF-β1 受體激酶底物之一，被認為是介導 TGF-β1 誘導纖維化的關鍵分子[12-13]，而Smad3在高糖誘導腎小管上皮細胞纖維化過程中的作用尚不明確，因此本研究通過觀察Smad3對高糖條件下腎小管上皮細胞轉分化的影響，探討Smad3在高糖誘導腎臟纖維化中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1主要試劑 腎小管上皮細胞株(吉妮歐，中國)，DMEM細胞培養(yǎng)基(Hyclone，美國)，Smad3抗體、P-Smad3(Ser423/425)抗體(CST，美國)，E-cadherin抗體、Desmin抗體(Santa Cruz公司，美國)，β-actin單克隆抗體 (普美，中國)，胎牛血清、胰酶(Gibco，美國)，一抗稀釋液、ECL 顯色劑、質粒提取試劑盒(碧云天，中國)，real-time PCR試劑(天根，中國)，Lipofectamine 3000(賽默飛，美國)。

1.1.2主要儀器 電泳系統(tǒng)及電轉移裝置(北京六一，中國)，凝膠成像系統(tǒng)、熒光定量 PCR 儀(Bio-Rad，美國)，DP72顯微鏡(OLYPUMS，日本)。

1.2 方法

1.2.1質粒構建 敲低Smad3質粒(Smad3-sh)和過表達Smad3質粒(OE-Smad3)均由上海毅樂公司設計合成，序列見表1。

表1 敲低Smad3質粒、空載質粒及過表達Smad3質粒序列Tab.1 Sequence of Smad3 knock down plasmid, vector of the plasmid and Smad3 overexpression plasmid

1.2.2細胞培養(yǎng)與分組 細胞生長融合度達 80%時，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用無菌 PBS 洗滌 3 次，棄上清液、吸干，加入胰蛋白酶(濃度為 0.25%，37 ℃預熱) 1 mL進行消化，細胞懸液均勻組鋪于6 孔板或相應培養(yǎng)皿中。隨機將細胞分為正常對照組(NC組)、正常糖組(NG組)、高糖組(HG組、空載組(vector組)、敲低Smad3質粒干預組(Smad3-sh組)及過表達Smad3質粒干預組(OE-Smad3組)，正常糖為5.5 mmol/L葡萄糖，高糖為30 mmol/L葡萄糖；各組于培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中孵育過夜。

1.2.3細胞轉染 待細胞融合至50%～60%時，進行轉染。配制轉染液：DMEM 培養(yǎng)液(不含血清及雙抗)、Lipofectamine 3000、質粒，瞬離、混勻，于無菌環(huán)境靜置 30 min；棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，并且加入已經混勻好的轉染液，輕晃混勻，于培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中孵育48 h。

1.2.4質粒效應檢測 (1)Real-time PCR實驗檢測Smad3 mRNA表達水平，按天根公司試劑盒說明書，用Trizol法提取各組大鼠腎組織的總 RNA；以20 μL反應體系反轉錄-聚合酶鏈反應合成cDNA，內參照β-actin及Smad3的引物由生物工程有限公司合成，內參照β-actin上游引物序列5′-ACCACCATGTACCCAGGCAT-3′，下游引物序列5′-CCGGACTCATCGTACTCCTG-3′)；Smad3上游引物序列5′-GCCGAGGGAACATCCTGTCT-3′，下游引物序列5′-CCACGTCACTGCGGAGACA-3′；采用Bio-Rad CFX 96TM 熒光定量 PCR分析系統(tǒng)進行RT-qPCR。(2)采用Western blot Smad3 蛋白表達水平，提取各組細胞蛋白，用BCA試劑盒(碧云天)測定各組蛋白質濃度，按所測得濃度計算每泳道所需體積，加入加樣緩沖液煮沸10 min，經8%的SDS-PAGE凝膠電泳分離，再轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入抗β-actin、Smad3及抗體，4 ℃孵育過夜；次日，TBST洗膜后，加入相應二抗(濃度均為1 ∶7 000)室溫孵育1 h，加ECL熒光顯色液，凝膠成像儀曝光，Image Lab軟件分析各條帶調整體積值，結果用目標蛋白/β-actin值表示。

1.2.5敲低和過表達Smad3對EMT的影響 選取正常對照組(NC)、空載組(vector)、敲低Smad3質粒干預組(Smad3-sh)及過表達Smad3質粒干預組(OE-Smad3)細胞，分別給予正常糖濃度及高糖濃度處理，于培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中孵育過夜。提取各組細胞蛋白，采用Western blot 法檢測Smad3、p-Smad3(Ser423/425)、E-cadherin及Desmin蛋白表達水平；提取各組細胞蛋白，用BCA試劑盒(碧云天)測定各組蛋白質濃度，按所測得濃度計算每泳道所需體積，加入加樣緩沖液煮沸10 min，經8%的SDS-PAGE凝膠電泳分離，再轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入抗β-actin、Smad3、p-Smad3(Ser423/425)、E-cadherin及Desmin抗體，4 ℃孵育過夜；次日，TBST洗膜后，加入相應二抗(濃度均為1 ∶7 000)室溫孵育1 h，加ECL熒光顯色液，凝膠成像儀曝光，Image Lab軟件分析各條帶調整體積值，結果用目標蛋白/β-actin值表示。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 E-cadherin及Desmin蛋白表達

結果顯示，NG組E-cadherin蛋白高表達，而Desmin表達較少；與NG組相比，HG組細胞E-cadherin蛋白表達減少，而Desmin蛋白表達增高，差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.05。見如圖1。

注：A為Western blot條帶，B為灰度值定量條圖；(1)與NG組比較，P<0.05。圖1 腎小管上皮細胞中E-cadherin和Desmin蛋白表達(Western blot)Fig.1 The effect of HG on the protein expression levels of E-cadherin, Desmin in NRK-52E cellsNG：normal glucose group;HG：high glucose group

2.2 質粒效應檢測

結果顯示，與NC組相比，vector組Smad3蛋白及mRNA水平表達均無顯著變化，而Smad3-sh組Smad3蛋白及mRNA表達均顯著減少(P<0.05)，蛋白敲低效率約為60%；OE-Smad3組Smad3蛋白及mRNA表達均顯著增加(P<0.05)，蛋白過表達約為3.5倍。見圖2。

2.3 敲低和過表達Smad3對EMT的影響

結果顯示，與NG組比較，HG刺激腎小管上皮細胞細胞后，p-Smad3/Smad3蛋白比值、Desmin蛋白表達水平均顯著增加，E-cadherin蛋白表達水平顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在NG情況下敲低Smad3后，p-Smad3/Smad3蛋白比值減少，Desmin蛋白表達水平略有減少，E-cadherin蛋白表達水平略有增加，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而在HG情況下敲低Smad3，Desmin蛋白表達水平顯著減少，E-cadherin蛋白表達水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在NG情況下過表達Smad3，p-Smad3/Smad3蛋白比值增加，Desmin蛋白蛋白表達水平略有增加，E-cadherin蛋白蛋白表達水平略有減少，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而在HG情況下過表達Smad3，Desmin蛋白表達水平顯著增加，E-cadherin蛋白表達水平顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

敲低Smad3 過表達Smad3注：A、B為Western blot條帶，C、D為灰度值定量條圖；(1)與NC組比較，P<0.05。圖2 各組腎小管上皮細胞細胞中Smad3蛋白及mRNA表達Fig.2 The protein expression levels and mRNA expression levels of Smad3 in Smad3-sh and OE-Smad3 NRK-52E cells

敲低Smad3 過表達Smad3注：A、B為Western blot條帶，C、D為灰度值定量條圖；(1)與NG+control組比較，P<0.05； (2)與HG+control組比較，P<0.05。圖3 敲低和過表達Smad3對EMT的影響(Western blot)Fig.3 The effect of Smad3 expression on HG-mediated E-cadherin and Desmin expression levels

3 討論

腎臟纖維化是慢性腎臟疾病 (chronic kidney disease,CKD) 的共有特征之一，以大量肌纖維母細胞的活化和細胞外基質 (extracellular matrix,ECM) 的過度沉積為主要特征，常導致腎功能的持續(xù)惡化，最終可能進展為終末期腎臟疾病 (end-stage renal disease,ESRD)[14]。目前，對于腎臟纖維化的發(fā)病機制還不明確，且臨床上缺乏有效治療措施[15]。肌成纖維細胞是分泌腎間質細胞外基質的主要細胞，在疾病狀態(tài)下，上皮細胞表達成纖維細胞表面標志物并發(fā)生向DM，從而分泌大量細胞外基質，最終將加重加快DN腎臟纖維化的進程[2-4]。本研究發(fā)現(xiàn)，正常糖培養(yǎng)的腎小管上皮細胞成纖維細胞標志物表達較少，向間充質細胞轉分化較少，而在高糖刺激之后，上皮細胞發(fā)生大量轉分化，成纖維細胞標志物表達顯著增加。課題組前期發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細胞EMT在腎纖維化中發(fā)揮重要作用，抑制上皮細胞轉分化將抑制或延緩DM腎臟纖維化以及HG誘導的腎小管上皮細胞纖維化進程[5-8]，提示尋找抑制EMT過程的有效靶點將為臨床上治療腎臟纖維化提供理論依據(jù)。

TGF-β1是公認的致纖維化因子，腎臟腎臟纖維化過程中發(fā)揮至關重要作用[14-15]。Smads作為主要的TGF-β1受體激酶底物，承擔著轉導通路中介分子的作用，將TGF-β1信號從細胞外傳遞到細胞核。根據(jù)結構和功能，Smad蛋白可分為3種亞型：(1)受體調控型Smad(R-Smad)，包括 Smad1、2、3、5、8；(2)共用型Smad(co-Smad)只有 Smad4；(3)拮抗型Smad (I-Smad)有Smad 6，7[12-15]。激活的TGF-β1通過跨膜的Ⅱ型(TβRⅡ)和Ⅰ型(TβRⅠ)絲氨酸/蘇氨酸激酶受體激活其下游的Smad2/3，Smad2/3隨后與Smad4形成復合物轉移入細胞核中，在核中Smad2/3/Smad4復合物可與轉錄輔激活劑p300/CBP相互作用，參與TGF-β1目的基因的轉錄活化，發(fā)揮其致纖維化效應誘導腎小管上皮細胞向間充質細胞轉分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)，促使細胞外基質(extracellular matrix,ECM)合成增加并抑制其降解而過度沉積，從而造成廣泛的腎組織纖維化[14-15]。Smad3 被認為是介導 TGF-β1 誘導纖維化的關鍵分子，敲除Smad3能抑制ECM沉積和EMT的發(fā)生，從而改善單側輸尿管梗阻所致的腎臟纖維化以及TGF-β1所誘導的體外腎小管上皮細胞纖維化[14,16]；并且TGF-β1激活Smad3可上調多種促纖維化的微小RNA(micoRNA)表達，包括miR-21、miR-129及miR-145[17-18]。本研究中，在高糖條件下培養(yǎng)的腎小管上皮細胞中，敲低Smad3抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞轉分化過程，并且過表達Smad3之后可以促進高糖誘導的腎小管上皮細胞轉分化，表明Smad3在高糖誘導的腎小管纖維化模型的作用與其他學者在其他腎臟纖維化模型中的作用一致[14,16]。腫瘤方面的研究發(fā)現(xiàn)，Smad3可以單獨與Smad4結合成Smad3/4復合物，并且結合在核轉錄共抑制因子(Ski-related novel protein N,SnoN)基因的SIE (Smad-inhibitory element)從而抑制SnoN基因轉錄，從而減少SnoN蛋白表達[19]。而SnoN蛋白是TGF-β1的負調控因子，它可以分別在細胞質和在細胞核中抑制TGF-β1信號通路的活化[20-21]。提示Smad3可能通過削弱SnoN對TGF-β1信號通路的負調控作用，從而促進HG誘導腎小管上皮細胞纖維化的發(fā)生，但具體機制還有待進一步研究。

綜上所述，Smad3 促進HG誘導腎小管上皮細胞轉分化過程，從而促進高糖介導的腎小管上皮細胞纖維化的發(fā)生。