洪偉，趙行行，吳昌學(xué)**，饒鳳琴，程玉梅，張婷，齊曉嵐，禹文峰，官志忠

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&貴州省分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 ICU，貴州 貴陽 550004)

嗜熱二型內(nèi)含子是高溫下(48～60 ℃)可在基因組中跳躍的可動基因元件[1]。嗜熱二型內(nèi)含子基因失活系統(tǒng)(Thermotargetron)由來源于Thermosynechococcuselongatus的TeI3c/4c嗜熱二型內(nèi)含子和內(nèi)含子編碼蛋白(intron-encoded protein, IEP)構(gòu)成，IEP具有將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶活性[2-5]。TeI3c/4c二型內(nèi)含子通過“歸巢(Retrohoming)”效應(yīng)靶向跳躍至基因組中“AAnnnnnnnnnnnnnA”位點(diǎn)(n為A、T、G及C任意堿基)，“歸巢”由TeI3c/4c嗜熱二型內(nèi)含子與IEP組成的核糖核蛋白復(fù)合體介導(dǎo)。在中溫梭菌中，基于LactococcuslactisLl.LtrB內(nèi)含子被開發(fā)為ClosTron基因失活工具，廣泛應(yīng)用于中溫菌的基因失活[6-10]。與中溫ClosTron系統(tǒng)使用IEP和LactococcuslactisLl.LtrB內(nèi)含子共同識別靶DNA序列不同，TeI3c/4c二型內(nèi)含子僅通過TeI3c/4c內(nèi)含子RNA識別靶DNA序列，DNA解鏈依賴高溫自發(fā)完成[1]。這一特點(diǎn)使得Thermotargetron在靶向短開放閱讀框和非編碼RNA時(shí)具有優(yōu)勢。更重要的是，在ClosTron系統(tǒng)中，由于Ll.LtrB二型內(nèi)含子需要使用誘導(dǎo)型啟動子控制其表達(dá)量，從而降低其脫靶的可能性[11-15]。然而，建立化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)(如乳糖誘導(dǎo)啟動子和脫水四環(huán)素誘導(dǎo)啟動子)本身對于某些中溫微生物比較困難，且表達(dá)強(qiáng)度不易控制。相比化學(xué)誘導(dǎo)而言，物理誘導(dǎo)(如溫度和光)更加簡單和精確。Thermotargetron系統(tǒng)在中溫環(huán)境中不具有“歸巢”活性，隨著溫度的提高，“歸巢”活性逐漸提高。因此，在可短暫耐高溫的中溫微生物中，Thermotargetron系統(tǒng)可通過精確控制在特定高溫條件下的保溫時(shí)間來控制Thermotargetron的基因打靶活力，從而提高打靶精確度。因此，本研究使用Thermotargetron系統(tǒng)構(gòu)建人腸道來源(中溫菌)大腸桿菌lacZ基因失活突變株，建立中溫菌溫度誘導(dǎo)型基因失活工具，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株與其培養(yǎng)條件

菌株與質(zhì)粒見表1及表2，基因失活實(shí)驗(yàn)在來源于白喉病人腸道的大腸桿菌(E.coli)HSM174(DE3)菌株中進(jìn)行。New England BioLabs express (NEB express) 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞用于基因克隆和載體構(gòu)建，E.coli在Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化子篩選時(shí)加入氯霉素(Chl，6 mg/L)。大腸桿菌37 ℃有氧培養(yǎng)，液體培養(yǎng)時(shí)搖床轉(zhuǎn)速200 r/min；篩選半乳糖苷酶(β-galactosidase，LacZ)突變株時(shí)，固體培養(yǎng)基(瓊脂糖濃度1.5 %)中加入終濃度500 mmol/L 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖苷(X-gal)和異丙基-β-D-硫代半乳糖苷以建立藍(lán)白斑篩選體系。

1.2 方法

1.2.1Thermotargetron靶位點(diǎn)尋找及突變引物設(shè)計(jì) 從National Center for Biotechnology Information(NCBI)數(shù)據(jù)庫中獲得E.coliHSM174(DE3)菌株LacZ基因序列。(1)在基因組尋找符合“AAnnnnnnnnnnnnnA”的序列，3’端A位點(diǎn)為TeI3c/4c二型內(nèi)含子插入位點(diǎn)，定義為+1位，插入位點(diǎn)在基因中的位置(起始密碼子ATG中的A為+1位，正義鏈為“s”，反義鏈為“a”)；(2)插入位點(diǎn)下游1核苷酸(nt)位定義為+2，上游1 nt位定義為-1；(3)-1到-6位為IBS1(intron binding site)；(4)-8到-13位為IBS2；(5)+1位為IBS3；(6)設(shè)計(jì)通用引物(TeI3cUNI)，突變引物1(xxxxIBS12)，突變引物2(xxxxEBS2s)、突變引物3(xxxxEBS1a)及突變野生型TeI3c/4c二型內(nèi)含子IBS2和IBS1位點(diǎn)引物(PCR產(chǎn)物長357 bp)，使其與尋找到的靶位點(diǎn)互補(bǔ)配對(即相互識別)；與IBS1、IBS2及IBS3互補(bǔ)的識別序列分別為EBS1(exon binding site)、EBS2及EBS3。

1.2.2質(zhì)粒構(gòu)建 在基因打靶載體構(gòu)建過程中，所有的PCR反應(yīng)都使用高保真DNA聚合酶(Phanta HS Super-Fidelity DNA Polymerase，諾唯贊，南京，中國)，所有的DNA片段連接均采用NEBuilder?HiFi DNA Assembly Master Mix (NEB)試劑盒進(jìn)行[16]，線性化質(zhì)粒載體酶BsiWI-HF及SpeI-HF均采購于NEB，并按說明書進(jìn)行酶切反應(yīng)。pHK-TT1A質(zhì)粒作為lacZ基因打靶載體的構(gòu)建構(gòu)建的“母版”[1]，具體為BsiWI，SpeI雙酶切、線性化pHK-TT1A質(zhì)粒。突變引物1-通用引物擴(kuò)增獲得EBS1(Exon binding site)、EBS2突變的PCR片段1，突變引物2-突變引物3擴(kuò)增獲得IBS1(intron binding site)、IBS2突變的PCR片段2，重疊PCR連接PCR片段1和2，獲得PCR片段3，PCR片段3與線性化的pHK-TT1A質(zhì)粒重組為基因打靶質(zhì)粒；基因打靶質(zhì)粒經(jīng)測序驗(yàn)證后，電轉(zhuǎn)化E.coliHSM174(DE3)菌株。

1.2.3Thermotargetron失活lacZ基因 Thermotargetron打靶質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化E.coliHSM174(DE3)菌株，轉(zhuǎn)化物涂布于氯霉素抗性LB培養(yǎng)基中(LB-Chl)，篩選具有氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化子(37 ℃)，轉(zhuǎn)化子接種到LB-Chl培養(yǎng)基中，200 r/min培養(yǎng)過夜；取50 μL過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至5 mL LB-Chl培養(yǎng)基中，37 ℃保溫1 h；此后，培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至48 ℃水浴中1 h誘導(dǎo)TeI3c/4c“歸巢”活性。誘導(dǎo)培養(yǎng)物，梯度稀釋后涂布于LB-Chl固體培養(yǎng)基上(1.5 %瓊脂，含500 mmol/L X-gal)，37 ℃過夜培養(yǎng)后，挑取白斑檢測lacZ基因是否失活[1]。另外，熱激1 h后的培養(yǎng)物也涂布在僅含有氯霉素不含有X-gal的平板上，隨機(jī)挑取20個(gè)克隆，以計(jì)算基因失活效率，基因失活效率=(突變株數(shù)量/20×100%)。

1.2.4丟失打靶質(zhì)粒 突變株連續(xù)在無抗生素的LB培養(yǎng)基中傳代10次后，劃線至LB固體培養(yǎng)基中分離單菌落。使用影印平板法，即用無菌牙簽挑取單菌落點(diǎn)到LB-Chl抗性平板上，并同時(shí)點(diǎn)到無抗性LB平板上，兩塊平板置于37 ℃過夜培養(yǎng)后觀察兩塊平板上的菌落形成情況。挑起在Chl抗性平板上不生長，在無抗性平板上生長的菌落，接種到5 mL液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)液加入15%終濃度的甘油-80 ℃保存。

2 結(jié)果

2.1 E. coli HSM174 lacZ 基因打靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)

E.coliHSM174lacZ基因(ECHMS174_00351)全長3 075 bp，在lacZ基因中5′-AAcgccatcaaaaatA-3′(426a)、5′-AAcggaactggaaaaA-3′(1 879a)、5′-AAa-cggaactggaaaA-3′(1 880a)及5′-AAgcagaacaactttA-3′(1 155s)四個(gè)位點(diǎn)符合TeI3c/4c識別規(guī)律(圖1A)。使用引物突變野生型TeI3c/4c IBS1、IBS2、EBS1及EBS2位點(diǎn)(圖1B)，構(gòu)建針對lacZ基因426a，1 879a，1 880a和1 155s四個(gè)識別位點(diǎn)的打靶質(zhì)粒pHK-TT1A-lacZ426a、pHK-TT1A-lacZ1879a、pHK-TT1A-lacZ1880a及pHK-TT1A-lacZ1155s(圖1)。

注：A為打靶位點(diǎn)在lacZ基因中的分布，B為打靶識別位點(diǎn)堿基組成特征。圖1 lacZ的特征及打靶位點(diǎn)在lacZ中的分布Fig.1 The characteristics of lacZ and distribution of shooting sites in lacZ

2.2 E. coli HSM174 lacZ 基因敲除載體的構(gòu)建

野生型TeI3c/4c的IBS1、IBS2、EBS1及EBS2位點(diǎn)的突變需要4條引物(圖2A)。pHK-TT1A-lacZ426a載體的構(gòu)建過程如下：首先，使用lacZ426aIBS12-Tel3cUNV引物突變野生型TeI3c/4c IBS1及IBS2位點(diǎn)(突變片段1)，lacZ426aEBS2s-lacZ426aEBS1a引物突變野生型TeI3c/4c EBS1及EBS2位點(diǎn)(突變片段2)，獲得2段攜帶突變位點(diǎn)PCR產(chǎn)物(圖2B)；以突變片段1和突變片段2作為模板，lacZ426aIBS12-lacZ426aEBS1a為引物，重疊PCR連接2段突變片段，獲得完整的靶位點(diǎn)識別序列。靶位點(diǎn)識別序列長357 bp(圖2C)，兩端攜帶SpeI，BsiWI酶切位點(diǎn)，與被相同限制性內(nèi)切酶線性化的pHK-TT1A載體重組連接，獲得pHK-TT1A-lacZ426a打靶載體(圖2D)。pHK-TT1A-lacZ1879a，pHK-TT1A-lacZ1880a和pHK-TT1A-lacZ1155s載體使用相同方法構(gòu)建(表1～表3)。

2.3 lacZ基因敲突變株鑒定

pHK-TT1A-lacZ426a、pHK-TT1A-lacZ1879a、pHK-TT1A-lacZ1880a及pHK-TT1A-lacZ1155s載體轉(zhuǎn)化E.coliHSM174感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化效率=104CFU/μg DNA。轉(zhuǎn)化子在LB-Chl的平板上(添加X-gal)形成白色和藍(lán)色的克隆(圖3A, 圖3B)。使用lacZ基因外側(cè)引物(DPlacZ-F/R)檢測白色克隆，突變株因TeI3c/4c插入，PCR檢測產(chǎn)物分子量比野生型大(WT=3176 bp vs mutant=3 976 bp，圖3C)，白色克隆lacZ失活率為100%(圖3C)。為了計(jì)算突變效率，轉(zhuǎn)化子被涂布在LB-Chl平板上，隨機(jī)挑選20個(gè)轉(zhuǎn)化子克隆(培養(yǎng)基中不加入X-gal)檢測lacZ基因是否插入失活。結(jié)果顯示pHK-TT1A-lacZ426a、pHK-TT1A-lacZ1879a、pHK-TT1A-lacZ1880a及pHK-TT1A-lacZ1155s打靶載體的基因失活效率分別為60%、75%、60%和75%(表4)。

注：A為野生型TeI3c/4c所需IBS1、IBS2、EBS1及EBS2位點(diǎn)的突變需要4條引物位置示意圖，B為含突變片段1及突變片段2攜帶的突變位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物，C為重疊PCR連接突變片段1及突變片段2后獲得的完整靶位點(diǎn)識別序列，D為獲得的pHK-TT1A-lacZ426a打靶載體示意圖。圖2 E. coli HSM174 lacZ 基因敲除載體的構(gòu)建Fig.2 Construction of E. coli HSM174 lacZ knockout vecto

表1 菌株序列(特征)及來源Tab.1 Strain sequence (characteristics) and its origin

表2 質(zhì)粒序列(特征)及來源Tab.2 Plasmid sequence (characteristics) and its origin

表3 引物序列(特征)及來源Tab.3 Sequence (characteristics) and Source of primers

注：A、B為轉(zhuǎn)化子在LB-Chl的平板上(添加X-gal)形成的白色及藍(lán)色的克隆(菌落)，C為白色克隆中突變株因TeI3c/4c插入片段的PCR檢測結(jié)果。圖3 藍(lán)白斑及PCR篩選lacZ基因突變株Fig.3 Screening of lacZ Gene Mutants by Blue and White spot and PCR

表4 Thermotargetron失活lacZ基因Tab.4 Thermoargtron-inactivated lacZ gene

3 討論

基于L1.LtrB的ClosTron是在中溫革蘭氏陽性和陰性微生物中廣泛使用的基因失活工具[17]，這些微生物包括E.coli，Salmonellatyphimurium，Shigellaflexneri[8]，Lactococcuslactis[18]，Clostridiumspp[19]，Staphylococcusaureus[20]Pseudomonasspp和Agrobacteriumtumefaciens[20]，Bacillusanthracis[21]和Listeriamonocytogenes[22]等。基于TeI3c/4c的Thermotargetron系統(tǒng)是ClosTron系統(tǒng)的很好補(bǔ)充，解決了ClosTron不能在嗜熱微生物中應(yīng)用的缺陷[1]。不僅如此，對于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)不完善，且可以短暫耐受高溫的中溫微生物，Thermotargetron具有獨(dú)特的優(yōu)勢：(1)可以使用溫度作為誘導(dǎo)條件，比化學(xué)誘導(dǎo)(如乳糖誘導(dǎo)啟動子，脫水四環(huán)素誘導(dǎo)啟動子)更加精確；(2)具有更低的脫靶可能性。本研究，使用人腸道來源的革蘭陰性E.coliHSM174作為中溫模式菌株，lacZ基因(易篩選)作為靶基因，使用Thermotargetron系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)(測試了4個(gè)位點(diǎn))的高效的基因失活(失活效率60%～75%)。

常規(guī)商業(yè)化的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(如DH5α，BL21)其基因組中的lacZ基因α片段都已經(jīng)被敲除，從而實(shí)現(xiàn)和載體上的lacZα片段實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)[1]。本研究選用人腸道來源的E.coliHSM174菌株具有完整的lacZ基因，因此可以將X-gal轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。當(dāng)TeI3c/4c二型內(nèi)含子跳躍至lacZ基因內(nèi)部的打靶位點(diǎn)，由于TeI3c/4c RNA內(nèi)部具有很多終止密碼子和頸環(huán)結(jié)構(gòu)，故能終止lacZ基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物翻譯為蛋白質(zhì)[1, 23]，實(shí)現(xiàn)lacZ基因的失活。失活后的lacZ不能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，喪失將X-gal轉(zhuǎn)化為藍(lán)色產(chǎn)物的能力，故在平板上形成白斑。當(dāng)挑取白斑檢測突變時(shí)，實(shí)際上已經(jīng)經(jīng)歷了一次突變株篩選，故突變率高達(dá)100%。然而，為了計(jì)算Thermotargetron針對lacZ基因的實(shí)際突變率，本研究重新將轉(zhuǎn)化子涂布在不含有X-gal的LB平板，隨機(jī)挑取20個(gè)克隆，計(jì)算得出實(shí)際基因失活效率為60%～75%。

應(yīng)用Thermotargetron失活中溫微生物基因，需要宿主細(xì)胞經(jīng)歷5～60 min不等的熱激步驟(48 ℃)，以誘導(dǎo)TeI3c/4c的歸巢活性，從而達(dá)到失活基因的目的[24]。在熱激過程中，微生物體內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)會短暫激活[25]，以應(yīng)對條件變化。這種應(yīng)激反應(yīng)往往是可逆的[26]。在突變株的后續(xù)處理中，突變株在無抗性的LB培養(yǎng)基中37 ℃連續(xù)轉(zhuǎn)接10次，lacZ426a、lacZ1879a、lacZ1880a及l(fā)acZ1155s的質(zhì)粒丟失效率分別是50%、65%、40%及100%。此步驟有2個(gè)目的：(1)丟失突變株中的Thermotargetron打靶質(zhì)粒；(2)使得突變株從熱應(yīng)激狀態(tài)恢復(fù)為正常狀態(tài)。

終上所述，本研究實(shí)現(xiàn)了Thermotargetron失活E.coliHSM174lacZ基因，驗(yàn)證了Thermotargetron在中溫菌中的應(yīng)用潛力，為中溫微生物基因編輯提供了新的思路。