馬艷弘，田麗敏，孫小華，崔晉，金秋瓊，楊國慧

（1.江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所，江蘇南京210014；2.蘇州西山國家現(xiàn)代農業(yè)示范園區(qū)有限責任公司，江蘇蘇州215111；3.東北農業(yè)大學園藝園林學院，黑龍江哈爾濱150030）

無花果（Ficus carica L.），別名天仙果、明目果、映日果、奶漿果，為?？茻o花果屬多年生木本植物，是一種藥食兼優(yōu)植物，具有很高的藥用營養(yǎng)價值[1]。無花果汁香氣濃郁、酸甜適口，既含有豐富的多糖、維生素、礦質元素等，還含有多酚、黃酮等生物活性物質，其果酒、飲料等相關產品在國內外市場及其暢銷。

多酚是無花果汁中重要的活性成分[2-3]，具有抗氧化和清除自由基功能，在抗癌、抗衰老、預防心腦血管疾病等方面具有很好的療效[4-6]。據(jù)報道，果汁中植物多酚含量和種類與其抗氧化能力密切相關。果汁制備的方法包括水浴法、壓榨法、離心法、酶法法、超聲波輔助法等[7-8]，其中酶解榨汁技術因其具有出汁率高、對果品中功能因子的提取效率高、果汁的生物活性高等優(yōu)點得到了廣泛運用。因此本研究采用酶解技術制備無花果汁，并通過響應面試驗優(yōu)化無花果汁的最佳酶解制汁工藝并考察其體外抗氧化活性，為無花果汁的產業(yè)化生產奠定了理論基礎與試驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

布萊瑞克無花果：蘇州西山國家農業(yè)示范有限責任公司。

纖維素酶（活力≥10 000 U/mg）、果膠酶（活力≥30 000 U/g）：合肥Biosharp生物科技有限公司；福林酚：上海源葉生物科技有限公司；DPPH：南京藤春生物科技發(fā)展有限公司；VC：西隴科學股份有限公司；羥自由基測試盒、總抗氧化能力試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

電子天平（PL303型）：梅特勒-托利多（上海）有限公司；打漿機（MJ-BL15U11型）：廣東美的生活電器制造有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DK-8D型）：上海精宏實驗設備有限公司；紫外可見分光光度計（D-8型）：上海奧析科學儀器有限公司；漩渦混合儀（XW-80A型）：海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 無花果酶解制汁工藝

稱取適量無腐爛、無破損的同一成熟程度的無花果洗凈，打漿成無花果漿，分別添加一定量的纖維素酶或果膠酶酶解一定時間，酶解結束后于90℃下滅酶5 min，4 000 r/min離心30 min取上清液，沉淀再重復處理1次，合并2次上清液備用，按照下列公式（1）計算出汁率。

1.3.2 無花果汁中多酚含量測定[9]

1.3.2.1 標準曲線的制作

配制濃度為1.0 mg/mL的沒食子酸標準母液；再稀釋為不同濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/mL）的對照品標準溶液。分別吸取1 mL不同濃度的對照品標準溶液，各加入5 mL蒸餾水和1 mL福林酚在避光下充分搖勻反應，再加入4 mL的5%碳酸鈉溶液，避光下混勻漩渦，45℃避光水浴1.5 h，冷卻，測定波長760 nm處的吸光值，繪制標準曲線，得到回歸方程為y=0.010 9x+0.002 1（R2=0.999 6）。

1.3.2.2 無花果汁中多酚含量的測定

精密吸取1 mL的無花果汁10倍稀釋液，分別加入5 mL蒸餾水和1 mL福林酚在避光下充分搖勻反應，再加入4 mL的5%碳酸鈉溶液，避光下混勻漩渦，45℃避光水浴1.5 h，冷卻，測定波長760 nm處的吸光值。以吸光值為Y值，根據(jù)標準曲線計算無花果汁中多酚含量。

1.3.3 單因素試驗設計

分別考察不同纖維素酶添加量分別為（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%），不同果膠酶添加量分別為（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%），不同酶解溫度（35、40、45、50、55、60、65 ℃），不同酶解時間（30、60、90、120、150、180 min）對無花果出汁率及汁多酚含量的影響，根據(jù)結果確定適宜的制汁條件。

1.3.4 響應面優(yōu)化試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果，以纖維素酶添加量、果膠酶添加量、酶解溫度、酶解時間為試驗因素，以出汁率與多酚含量為響應值，采取BOX-Benhnken中心組合設計進行四因素三水平試驗設計[10]，通過Design-Expert 8.06軟件優(yōu)化酶解制汁工藝參數(shù)。各因素的水平表見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素和水平編碼表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

1.3.5 無花果汁體外抗氧化活性測定[11-12]

1.3.5.1 DPPH自由基清除率的測定

配置0.05 mg/mL的DPPH自由基溶液，根據(jù)無花果中的多酚含量稀釋果汁，使其果汁中多酚含量分別0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL，取不同體積的多酚溶液以及同濃度的VC溶液，加去氧水補足1 mL，分別加入5 mL DPPH溶液，混合均勻后避光反應30 min，用分光光度計分別測定517 nm處的吸光值A1，5 mL DPPH溶液與1 mL無水乙醇混合后測得的吸光度A0，5 mL無水乙醇與1 mL多酚溶液混合后測得的吸光度A2。按照公式（2）計算不同多酚濃度下無花果汁的DPPH自由基清除率。

式（2）中：A1為樣品組吸光度；A2為對照組吸光度；A0為空白組吸光度。

1.3.5.2 羥自由基清除率的測定

根據(jù)無花果中的多酚含量稀釋果汁，使其果汁中多酚含量分別 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL，按照試劑盒說明書操作，分別取500 μL含不同質量濃度多酚的無花果汁和VC溶液，測定550 nm處的吸光值。按照式（3）計算羥自由基清除率。

1.3.5.3 總抗氧化能力測定

根據(jù)無花果中的多酚含量稀釋果汁，使其果汁中多酚含量分別 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL，按照試劑盒說明書操作，以同濃度的VC溶液為對照，測定不同多酚濃度下無花果汁的總抗氧化能力。

1.4 數(shù)據(jù)分析

各試驗均做3次平行處理，結果取平均值。數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行誤差分析，Design-Expert 8.06軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 纖維素酶添加量對無花果出汁率及汁中多酚含量的影響

纖維素酶添加量對無花果出汁率及汁中多酚含量的影響見圖1。

圖1 纖維素酶添加量對無花果出汁率及汁多酚含量的影響Fig.1 Effect of cellulase amount on fig juice yield and polyphenol content in the juice

如圖1所示，纖維素酶添加量低于2.5%時，出汁率和多酚含量隨著纖維素酶添加量的增加而升高，在纖維素酶添加量為2.5%時，出汁率和多酚含量最高，分別達到74.33%和598.13 μg/mL；當纖維素酶添加量超過2.5%時，出汁率和多酚含量隨著纖維素酶添加量的增加而緩慢下降。這是由于隨著纖維素酶濃度的提高，酶解效率提高，導致出汁率和汁中多酚含量升高；當纖維素酶量達到最佳值時，則酶解反應徹底，出汁率和多酚釋放量最高；當纖維素酶的濃度超過最佳值，酶量過剩導致溶液體系粘度提高，反而限制了酶解反應速率[13-15]，導致了出汁率和多酚溶出量的降低。因此，確定纖維素酶的適宜添加量為2.5%。

2.1.2 果膠酶添加量對無花果出汁率及汁中多酚含量的影響

果膠酶添加量對無花果出汁率及汁中多酚含量的影響見圖2。

圖2 果膠酶添加量對無花果出汁率及汁多酚含量的影響Fig.2 Effect of pectinase amount on fig juice yield and polyphenol content in the juice

如圖2所示，當果膠酶添加量低于0.6%時，出汁率和多酚含量隨著果膠酶添加量的增加而升高，且在果膠酶添加量為0.6%時，出汁率和多酚含量最高，分別達到71.44%和604.19 μg/mL，當果膠酶添加量超過0.6%時，出汁率和多酚含量隨著果膠酶添加量的增加而緩慢下降。因此，確定的果膠酶添加量以0.6%為宜。

2.1.3 酶解溫度對無花果出汁率及汁中多酚含量的影響

酶解溫度對無花果出汁率及汁中多酚含量的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對無花果出汁率及汁多酚含量的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on fig juice yield and polyphenol content in the juice

如圖3所示，當酶解溫度在35℃～50℃時，出汁率和多酚含量隨著溫度的升高而升高，且在50℃時，出汁率和多酚含量最高，分別達到73.88%和605.16 μg/mL；當溫度超過50℃時，出汁率和多酚含量隨著溫度的升高而下降。這是由于生物酶的活性具有最適合的溫度，當溫度超過最適溫度時，酶活性降低，會直接抑制酶解反應速度，從而導致出汁率和多酚含量降低。因此，確定50℃為最佳酶解溫度。

2.1.4 酶解時間對無花果出汁率及汁中多酚含量的影響

酶解時間對無花果出汁率及汁中多酚含量的影響見圖4。

圖4 酶解時間對無花果出汁率及汁多酚含量的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on fig juice yield and polyphenol content in the juice

如圖4所示，酶解時間小于90 min時，出汁率和多酚含量隨著時間的延長而升高，且在90 min時，出汁率和多酚含量最高，分別達到73.12%和622.90 μg/mL；當時間超過90 min時，出汁率和多酚含量隨著時間的延長而下降。這是因為隨著時間延長，酶活力可以得到充分發(fā)揮，酶解反應較完全，出汁率和多酚釋放量不斷升高，在最適宜的時間達到最高值；但是酶解時間越長，水份蒸發(fā)及多酚氧化程度加大，會導致出汁率和多酚釋放量的降低。因此，確定90 min為適宜的酶解時間。

2.2 響應面優(yōu)化結果與分析

2.2.1 回歸模型建立與顯著性檢驗

利用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-benhnken中心組合設計響應面試驗，以纖維素酶添加量、果膠酶添加量、酶解溫度、酶解時間4個因素為響應因子，出汁率和多酚含量為響應值，進行三因素四水平的響應面試驗設計，結果如表2所示。

表2 響應面試驗結果Table 2 Results of response surface tests

續(xù)表2 響應面試驗結果Continue table 2 Results of response surface tests

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的響應面試驗數(shù)據(jù)進行多項回歸擬合分析，建立二次多項回歸方程如下：

從方差分析表3和表4可以看出，2個模型方程極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著，說明該模型所建立的回歸方程擬合度較好，試驗選取的各因素與無花果出汁率與多酚含量之間的相關性很好[16]。其中A、B、C、AC、AD、BC、CD、A2、B2、C2、D2對無花果出汁率的影響極顯著，BD對無花果出汁率的影響顯著。4個因素影響無花果出汁率的主次因素為：酶解溫度＞纖維素酶添加量＞果膠酶添加量＞酶解時間。AD、BC、CD、A2、B2、C2、D2對無花果汁多酚含量的影響極顯著，B、C、D、AB對無花果汁多酚含量的影響顯著。由一次項的P值可知，影響無花果汁多酚含量的主次因素為：酶解溫度＞酶解時間＞果膠酶添加量＞纖維素酶添加量。

表3 出汁率回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of juice yield regression model

表4 多酚含量回歸模型方差分析Table 4 ANOVA of response surface model

2.2.2 響應面分析與優(yōu)化

響應面分析圖是指在其他因素水平穩(wěn)定的條件下，響應值與試驗中2個因素所構成的三維曲線面圖，可以直觀反映各因素之間的相互作用對響應值的影響大小。響應面曲面坡度較陡峭，表明因素變化對響應值的影響顯著。以出汁率和多酚含量作為共同評價指標，最佳交互項影響具體結果見圖5～圖7。

由圖5～圖7可以看出，纖維素酶添加量與酶解時間（AD），果膠酶添加量與酶解溫度（BC），酶解溫度與酶解時間（CD）坡面陡峭，對無花果出汁率及其多酚含量的交互影響作用均極顯著。

圖5 纖維素酶添加量與酶解時間對無花果出汁率及汁多酚含量影響的響應面Fig.5 Response surface plots for the effects of cellulase amount and enzymolysis time on fig juice yield and polyphenol content in the juice

圖6 果膠酶添加量與酶解溫度對無花果出汁率及汁多酚含量影響的響應面Fig.6 Response surface plot for the effects of pectinase amount and enzymolysis temperature on fig juice yield and polyphenol content in the juice

圖7 酶解溫度與酶解時間對無花果出汁率及汁多酚含量影響的響應面Fig.7 Response surface plot for the effects of enzymolysis temperature and enzymolysis time on fig juice yield and polyphenol content in the juice

以出汁率為指標，通過軟件分析，得出最優(yōu)酶解工藝參數(shù)為：纖維素酶添加量2.49%、果膠酶添加量0.57%、酶解溫度47.68℃、酶解時間92.60 min，預測理論無花果出汁率為77.763 5%；以多酚含量為指標，得出最優(yōu)酶解工藝參數(shù)為：纖維素酶添加量2.47%、果膠酶添加量0.62%、酶解溫度50.85℃、酶解時間89.28 min，預測理論多酚含量為622.136 μg/mL。為操作方便，將上述工藝參數(shù)修正為纖維素酶添加量2.5%、果膠酶添加量0.6%、酶解溫度50℃、酶解時間90 min，測得實際出汁率為75.13%，實際多酚含量為626.79 μg/mL，與預測值十分接近。該模型可靠，可以用來預測產業(yè)化生產中無花果汁的出汁率及其多酚含量。

2.3 無花果汁體外抗氧化性試驗結果與分析

2.3.1 不同多酚含量無花果汁的DPPH自由基清除率無花果汁多酚對DPPH·清除率見圖8。

圖8 無花果汁多酚對DPPH·清除率Fig.8 Scavenging rate of polyphenols in fig juice on DPPH·

由圖8得知，無花果汁中多酚濃度在0.1 mg/mL～0.5 mg/mL之間，果汁對DPPH自由基的清除率隨著多酚濃度的增加而提高；當多酚濃度達0.6 mg/mL，果汁對DPPH自由基的清除率最高（90.26%）。表明無花果果汁具有較強的DPPH自由基清除能力，但其自由基清除率略低于同濃度下VC的自由基清除率。

2.3.2 不同多酚含量無花果汁的羥自由基清除率

無花果汁多酚抑制羥自由基活力見圖9。

圖9 無花果汁多酚抑制羥自由基活力Fig.9 Inhibition of hydroxyl radical activity by polyphenols in fig juice

由圖9得知，無花果汁中多酚濃度在0.1 mg/mL～0.4 mg/mL之間，果汁對羥自由基的抑制率隨著多酚濃度的增加而提高，當無花果汁多酚濃度為0.6 mg/mL時，果汁的抗羥自由基活力高達250.96 U/mL；之后逐漸趨于平緩。表明一定濃度的無花果汁具有羥自由基抑制活力。但略低于同濃度下VC的羥自由基清除活力。

2.3.3 不同多酚含量無花果汁的總抗氧化能力

無花果汁多酚總抗氧化能力見圖10。

圖10 無花果汁多酚總抗氧化能力Fig.10 Total antioxidant capacity of polyphenols in fig juice

由圖10得知，在所設多酚濃度范圍內，無花果汁的總抗氧化能力隨著濃度的增加而增強；當濃度在0.5 mg/mL～0.6 mg/mL之間，總抗氧化能力趨于穩(wěn)定。多酚濃度為0.6 mg/mL無花果汁的總抗氧化能力最高，為84.35單位/mL。各多酚含量無花果汁的總抗氧化能力均低于同一濃度下VC溶液的抗氧化能力。

3 結論

本研究以無花果為原料，采用生物酶解法制備無花果汁，并通過單因素試驗與響應面分析法優(yōu)化了最優(yōu)酶解制汁工藝，建立了可靠的數(shù)學模型，得到了無花果汁的最佳酶解制汁工藝參數(shù)為：纖維素酶添加量2.5%、果膠酶添加量0.6%、酶解溫度50℃、酶解時間90 min，在此條件下無花果的出汁率為75.13%，汁中多酚含量高達626.79 μg/mL。通過果汁的DPPH自由基清除能力、抗羥自由基活力、及其總抗氧化能力的檢測發(fā)現(xiàn)，酶解制備的無花果果汁具有較強的抗氧化活性，0.6 mg/mL多酚濃度的果汁，其DPPH自由基清除率、抗羥自由基活性、總抗氧化活力分別達90.26%、250.96 U/mL、84.35單位/mL。