趙拯浩，王步森，王玉東，朱丹妮，董銘心，侯利華，陳薇

軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所，北京100071

內(nèi)含肽（intein）是位于宿主蛋白質(zhì)中的一段插入序列。經(jīng)典內(nèi)含肽結(jié)構(gòu)由催化蛋白剪接的N端和C 端剪接結(jié)構(gòu)域以及位于中央的歸巢內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)成一個馬蹄鐵狀的結(jié)構(gòu)[1]，其對應(yīng)的核苷酸序列嵌合在宿主蛋白對應(yīng)的核酸序列中，與宿主蛋白基因存在于同一開放讀框內(nèi)，并與宿主蛋白基因進行同步轉(zhuǎn)錄和翻譯。當(dāng)翻譯形成蛋白質(zhì)前體后，內(nèi)含肽從蛋白質(zhì)前體中切除，從而產(chǎn)生成熟的宿主蛋白[2-3]。在此過程中，內(nèi)含肽序列被準(zhǔn)確切除，而其兩側(cè)被稱為外顯肽（extein）的2 段宿主蛋白質(zhì)序列則通過正常的肽鍵連接起來。內(nèi)含肽在多種環(huán)境下形成和清除肽鍵的能力，使得其發(fā)展成為分子生物學(xué)強有力的工具，應(yīng)用于蛋白質(zhì)修飾、純化、生物傳感器等領(lǐng)域[4-6]。

天然內(nèi)含肽的自剪接不需要ATP、酶及小分子的參與，但這種自剪接的功能是不利于外部調(diào)控的。Liu 等[7]基于天然內(nèi)含肽結(jié)構(gòu)，開發(fā)了一種基于內(nèi)含肽的分子開關(guān)，這個分子開關(guān)可將小分子的結(jié)合轉(zhuǎn)化成目標(biāo)蛋白質(zhì)的激活。這種可以利用小分子4-羥基他莫昔芬（4-hydroxytamoxifen，4-HT）調(diào)控的內(nèi)含肽最早來源于結(jié)核分枝桿菌RecA 內(nèi)含肽結(jié)構(gòu)中的部分序列，在融合了304～551 氨基酸殘基的人雌激素受體配體結(jié)合域（estrogen receptor-ligand binding domain，ER-LBD）后，得到了含有424 個氨基酸殘基的內(nèi)含肽融合蛋白。為了使這一內(nèi)含肽融合蛋白在哺乳動物細胞中也能高效應(yīng)用，Peck 等[8]通過反復(fù)誘變和選擇，產(chǎn)生了高度依賴4-HT 的具有強剪接活性的內(nèi)含肽，得到一套低背景、快速剪切、適用哺乳動物細胞的內(nèi)含肽系統(tǒng)。

目前國外文獻報道利用這種分子開關(guān)能夠?qū)崿F(xiàn)對包括Cas9[9-10]、增強型綠色熒光蛋白（eGFP）[7]和卡那霉素抗性蛋白[11]在內(nèi)的多種蛋白的調(diào)控作用，國內(nèi)尚無利用這種分子開關(guān)的相關(guān)報道。本實驗旨在驗證小分子調(diào)控的內(nèi)含肽剪接技術(shù)在eGFP 上應(yīng)用的效率，針對eGFP 的結(jié)構(gòu)與功能在其基因上篩選出剪接效率更高的位點，并基于篩選結(jié)果，摸索小分子的最適工作條件。

1 材料與方法

1.1 材料

pVax-Intein 質(zhì)粒由上海生工公司合成；質(zhì)粒提取試劑盒（Promega，A1223）；膠回收試劑盒（TaKaRa，9762）；DNA 片段回收試劑盒（TaKaRa，9761）；PremixTaq預(yù)混液（TaKaRa，RR902）；2×Q5 PCR 聚合酶（NEB，M0494S）；高保真DNA 組裝預(yù)混液（NEB，E2621L）；六孔細胞培養(yǎng)板（Corning）；凝膠成像儀（Clinx Science，GenoSens 1560）；超微量分光光度計（GE，NanoVue Plus）；PCR 擴增儀（Eppendorf AG 22331 Hamburg）；熒光顯微鏡（BioTek，CY71V）；流式細胞儀（BD FACSCantoⅡ）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（泰斯特，DH5000BⅡ）；恒溫振蕩器（Crystal，IS-RDV1）。

1.2 擴增內(nèi)含肽片段與線性化載體pMD-eGFP

根據(jù)改構(gòu)的4-HT 可調(diào)控的內(nèi)含肽與eGFP 基因（GenBank：NC025025.1）序列[8]，用Vector NTI 設(shè)計PCR 引物（表1）。以Vax-Intein、pMD-eGFP 質(zhì)粒（實驗室保存）為模板進行PCR 擴增（擴增條件：94℃5 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s/kb，32 個循環(huán)；72℃5 min）。50 μL 擴增體系包括模板10 ng，上、下游引物各0.5 μmol/L，2×Q5熱啟動PCR 聚合酶25 μL，加22 μL 超純水補齊50 μL。PCR 結(jié)束后4℃保存產(chǎn)物，行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳畢，用凝膠成像系統(tǒng)對膠進行觀察，對符合預(yù)期的條帶用膠回收試劑盒回收。

1.3 重組載體pMD-eGFP-Intein 的構(gòu)建和陽性克隆鑒定

將1.2 中回收的內(nèi)含肽片段與線性化載體片段引物以摩爾比2∶1 的比例總計3 μL 加入0.25 mL EP 管中，添加NEBuilder 2×Mix 5 μL，去離子水補齊10 μL，混勻后在50℃金屬浴上重組反應(yīng)15 min。反應(yīng)結(jié)束后，立即放入冰中冷卻，后放入4℃暫存。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入TOP10 感受態(tài)大腸桿菌，菌液涂布于含50 μg/mg 氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜，從轉(zhuǎn)化平板中挑取單菌落各4 個，劃線培養(yǎng)，并進行菌落PCR，引物為InteinF/R。PCR 反應(yīng)體系（20 μL）包括模板（菌落），正、反向引物各0.4 μL，PremixTaq預(yù)混液10 μL，加水補齊20 μL。擴增條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，32 循環(huán)；72℃ 5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。從平板上挑取鑒定陽性菌落在5 mL 含氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)14～16 h，提取質(zhì)粒后測序確定目的序列。

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293 細胞系

293 T 細胞以3.5×105～5×105/孔接種至12 孔板，于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培育14～16 h，使細胞密度達到60%～70%。在1.5 mL 離心管中加入100 μL Opti-MEM 培養(yǎng)基，隨后按每孔1 μg質(zhì)粒、2 μL Turbofect 轉(zhuǎn)染試劑在離心管中配制轉(zhuǎn)染體系，混勻后室溫靜置15 min，滴加至12 孔板中，輕搖混勻。在實驗組中加入4-HT 的DMSO溶液1 μL，終濃度為1 μmol/L，在對照組中加入1 μL DMSO。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞熒光強度

轉(zhuǎn)染36 h 后，移除1.4 中的細胞上清，每孔用1 mL PBS 漂洗1 次后加入300 μL 1%胰酶，37℃孵育2 min。用1 mL PBS 將細胞吹打重懸并轉(zhuǎn)移至流式管中，4℃、600 r/min 離心5 min。棄上清，重新用3 mL PBS 重懸細胞，再次4℃、600 r/min 離心5 min，棄上清，用150 μL PBS 重懸細胞，流式上機檢測FITC 值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用t檢驗分析比較添加小分子的實驗組與對照組的熒光強度，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.01為差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。

1.7 4-HT 最適濃度的探究

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞步驟同1.4。轉(zhuǎn)染細胞后，分別在實驗組中添加梯度稀釋的4-HT，使4-HT 在培養(yǎng)基中的終濃度分別為16、8、4、2、1、2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-7、2-9、2-11、2-13、2-15μmol/L。后續(xù)檢測及統(tǒng)計學(xué)處理同1.5 和1.6。

2 結(jié)果

2.1 pMD-eGFP-Intein 的構(gòu)建

eGFP 能夠在藍色光的激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。eGFP 的發(fā)光依賴于其緊密的β桶結(jié)構(gòu)，在內(nèi)含肽替換位點的選取上主要考慮4-HT 容易接觸到的β桶的外側(cè)以及β桶兩端的無規(guī)卷曲區(qū)域，期望能夠?qū)崿F(xiàn)內(nèi)含肽在剪接前因破壞了eGFP 發(fā)色團共軛結(jié)構(gòu)而使eGFP 不能發(fā)出熒光，而內(nèi)含肽發(fā)生剪接后eGFP 發(fā)色團共軛結(jié)構(gòu)得到恢復(fù)，可以正常發(fā)光，從而實現(xiàn)小分子對eGFP 蛋白功能的調(diào)控。由于內(nèi)含肽的剪接會殘留一個半胱氨酸殘基，因此選取半胱氨酸以及與半胱氨酸結(jié)構(gòu)相似的丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。在eGFP 蛋白上選取C49、C71、S87、R109、A111、S148、T231 共7個位點插入內(nèi)含肽。所選取的位點在eGFP 基因組中的位置以及在eGFP 結(jié)構(gòu)上的位置參見圖1。在選取的位點處通過反向PCR 對質(zhì)粒進行線性化，與PCR 得到的內(nèi)含肽片段進行同源重組，測序分析后，獲得序列正確的7 個pMD-eGFP-Intein 質(zhì)粒。

2.2 內(nèi)含肽對eGFP 蛋白的調(diào)控

293 T 細胞分別轉(zhuǎn)染7 個不同位點嵌入內(nèi)含肽的重組eGFP 質(zhì)粒36 h 后，未添加4-HT 的對照組均未檢測到顯著的綠色熒光，說明內(nèi)含肽的插入影響了eGFP 的正常結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致無法激發(fā)綠色熒光。在7 個添加了4-HT 的試驗組中，S87、S148、R109 組可見顯著的熒光恢復(fù)（圖2）。在這3 組中，S148 位點插入的eGFP 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后熒光恢復(fù)強度最高，S87 次之，R109 最低。其中，R109是文獻中已報道的內(nèi)含肽調(diào)節(jié)eGFP 發(fā)光的剪接位點[7]，能夠觀測到熒光的部分恢復(fù)，但恢復(fù)效率不高，其他插入位點在熒光顯微鏡下未見熒光。

轉(zhuǎn)染36 h 后收集細胞，采用流式細胞術(shù)定量檢測細胞中eGFP 的熒光強度。結(jié)果顯示（圖3），A111、S148、S87、C71、R109 組添加4-HT 后，熒光強度強于未添加4-HT 的對照組，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。其中S87、S148、R109 組的熒光強度顯著強于對照組（P＜0.01），這3 組相較于陽性對照，加入4-HT 后熒光強度恢復(fù)率分別為31%、9%和5%（圖3），S148 組熒光恢復(fù)率最高，而R109 組的熒光恢復(fù)率較低，這與熒光觀測結(jié)果相吻合。未加4-HT 的對照組，熒光強度僅為陽性對照組的6%、3%和2%。同時也發(fā)現(xiàn)，剪接效率較高的位點，如S87、S148，其本底值（未添加4-HT 的對照組的熒光強度）也會略高。通過比較有/無4-HT 的熒光比值，可以看出S148、S87 的剪切效率分別為R109 的8 倍和2 倍。

圖1 pMD-eGFP-Intein 的構(gòu)建

2.3 4-HT 最適濃度的探究

選擇剪接效率最高的S148 位點進行實驗，探究該位點對應(yīng)的4-HT 最適濃度。將12 孔板中4-HT 的濃度從16 μmol/L 梯度稀釋至2-15μmol/L，在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞36 h 后流式檢測熒光強度，發(fā)現(xiàn)S148 位點的內(nèi)含肽剪接效率是高度劑量依賴的，濃度低于4 μmol/L 時，剪接效率與4-HT 的濃度正相關(guān)，最適濃度定為4 μmol/L（圖4）。

圖2 4-HT 調(diào)控eGFP 熒光檢測結(jié)果

3 討論

小分子依賴的內(nèi)含肽調(diào)控系統(tǒng)是一類非常有吸引力的分子開關(guān)，原則上它們可以插入感興趣的任意蛋白質(zhì)中，使得蛋白質(zhì)功能依賴于小分子的激活。與轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的條件控制相比，內(nèi)含子剪接過程非?？焖?，因此，在通過激活轉(zhuǎn)錄或翻譯不能實現(xiàn)的時間尺度上添加小分子效應(yīng)物后，可以激活積累的預(yù)裂蛋白。此外，與更常見的配體誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄行為相比，這種翻譯后激活取決于添加的小分子的濃度。因此，小分子激活的內(nèi)含肽技術(shù)兼具小分子化學(xué)遺傳方法的目標(biāo)特異性與經(jīng)典遺傳學(xué)方法的通用普遍性特點。將進化的內(nèi)含肽蛋白插入活細胞中的多種不相關(guān)蛋白質(zhì)中，證實蛋白質(zhì)功能的配體依賴性激活是普遍的、迅速的、劑量依賴性的和翻譯后修飾的。該過程不需要特定的細胞環(huán)境以及輔助因子的參與，甚至可以在體外進行。內(nèi)含肽因其獨特的剪接功能，在蛋白質(zhì)工程、基因診斷和治療、轉(zhuǎn)基因植物研究等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

圖3 流式細胞術(shù)檢測熒光強度

圖4 4-HT 濃度對剪接效率的影響

針對內(nèi)含肽剪接的特點與eGFP 的結(jié)構(gòu)與功能，利用同源重組的方法，我們將小分子調(diào)控的內(nèi)含肽基因分別嵌入eGFP 蛋白中7 個可能的氨基酸位點，得到7 種pMD-eGFP-Intein 重組質(zhì)粒。在所選取的7 個氨基酸位點中，包括文獻報道的R109 在內(nèi)的3 個插入位點能夠?qū)崿F(xiàn)小分子對eGFP 蛋白功能的調(diào)控，新發(fā)現(xiàn)的2 個插入位點S87 與S148 的剪接效率分別為9%和31%，遠高于文獻報道的剪接位點R109（剪接效率5%）。同時我們也發(fā)現(xiàn)，在剪接效率較高的位點，本底值相應(yīng)也略高，這可能是由于在高效率剪接的位點上除了內(nèi)含肽上受體結(jié)合域與4-HT 的碰撞幾率更高之外，內(nèi)含肽自身的N 端與C 端結(jié)構(gòu)域也比較靠近，自剪接的發(fā)生概率也會更高一點。

在S148 位點上，探究了4-HT 的最適濃度。發(fā)現(xiàn)4-HT 濃度在4 μmol/L 以下時，剪接效率與4-HT 濃度呈正相關(guān)，而當(dāng)4-HT 濃度達到4 μmol/L 時，剪接效率不再增加，這說明在S148 位點上，4-HT 的最適濃度約為4 μmol/L，與文獻報道的R109 位點的最適工作濃度為1 μmol/L 存在差異，說明在所選取的不同調(diào)控位點上，4-HT 的最適濃度存在差異。由于差異不是很大，所以如果探究內(nèi)含肽對于其他蛋白的調(diào)控，可以先選取1 μmol/L 尋找內(nèi)含肽的替換位點，然后在調(diào)控效果較好的位點上摸索4-HT 工作濃度。

本實驗驗證了小分子依賴的內(nèi)含肽剪接技術(shù)在eGFP 蛋白上應(yīng)用的可行性，相較于文獻報道的位點得到了剪接效率更高的位點，并摸索了在相應(yīng)位點上的小分子工作濃度，為后續(xù)這項剪接技術(shù)的應(yīng)用打下了良好基礎(chǔ)。