魯仕豪，石萍萍，2，王甜甜，吳軍，劉波

1.軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所，北京100071；2.安徽大學(xué)物質(zhì)科學(xué)與信息技術(shù)研究院，安徽合肥230000

近年來，生物技術(shù)藥物發(fā)展迅速，以單克隆抗體為首的重組生物制品在許多重大疾病的預(yù)防、診斷和治療中得到廣泛應(yīng)用，是當(dāng)今新藥研發(fā)的重點。目前已經(jīng)上市的單克隆抗體藥物都是使用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)制備，如最常見的中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）、鼠雜交瘤細(xì)胞（NSO）等。但動物細(xì)胞生長緩慢，構(gòu)建穩(wěn)定的工程細(xì)胞株所需時間長，且生產(chǎn)工藝放大和規(guī)模生產(chǎn)均存在一些瓶頸問題，難以滿足應(yīng)對突發(fā)生物危害時，對防生抗體的快速、大量的需求。巴斯德畢赤酵母作為最簡單的真核生物，具有繁殖速度快、培養(yǎng)成本低、遺傳操作性強(qiáng)，并且作為真核生物具有一定的折疊加工和翻譯后修飾能力等特點，已經(jīng)被廣泛用于各類生物制品的表達(dá)和生產(chǎn)[1]。野生型畢赤酵母對重組蛋白的糖基化修飾與哺乳動物細(xì)胞復(fù)雜型糖鏈不同，是形成高甘露糖型蛋白。這類蛋白由于末端的甘露糖在體內(nèi)容易被清除，導(dǎo)致半衰期縮短。并且高甘露糖型對生物學(xué)活性、抗體效應(yīng)作用、藥代動力學(xué)和免疫原性都存在一定的影響，從而限制了畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)制備重組糖蛋白的應(yīng)用。

本研究團(tuán)隊構(gòu)建的新型工程化畢赤酵母通過對N-糖基化修飾途徑的定向改造，順利阻斷了高甘露糖修飾，敲除和引入多種酶，使其具有類似于哺乳動物細(xì)胞復(fù)雜型糖基化修飾能力，為抗體等糖蛋白的制備提供了新的途徑[2-6]。本研究團(tuán)隊使用糖基工程酵母系統(tǒng)表達(dá)制備重組單克隆抗體和疫苗項目正在進(jìn)行中，目前已進(jìn)入中試制備生產(chǎn)前階段。由于是國內(nèi)首次利用畢赤酵母系統(tǒng)制備重組單克隆抗體，有針對性的臨床前質(zhì)量控制研究資料極度缺乏。生物制品中殘余的宿主細(xì)胞的DNA 由于存在潛在致癌風(fēng)險，一直以來都是非常重要的質(zhì)量控制內(nèi)容之一。針對宿主細(xì)胞DNA 殘余，2015 版《中華人民共和國藥典》三部中有明確規(guī)定：哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)品中其含量不超過100 pg/劑量，酵母表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)品中其含量不得超過10 ng/劑量[7]。實時熒光定量PCR 自1993 年問世以來[8]，憑借著其特異性強(qiáng)、靈敏度高、污染少、快速便捷，逐漸應(yīng)用于抗體外源DNA 殘余量的測定，能在一定程度上解決抗體外源DNA 殘余量測定的難題[9]，目前已經(jīng)逐步成為新藥報批質(zhì)量控制中對宿主DNA 殘余檢測的主要技術(shù)之一，但藥典尚未公布基于工程化酵母表達(dá)重組蛋白的DNA 殘余的實時熒光定量PCR 檢測方法。

5S rRNA 基因在畢赤酵母中具有多達(dá)20 多個拷貝，廣泛分布于各染色體上，即使在基因組不完整的情況下也很容易被檢測到，適合作為DNA 殘余檢測的標(biāo)志物。本研究通過對實時熒光定量PCR 方法的優(yōu)化，選擇畢赤酵母中的5S rRNA 作為檢測基因，完成了DNA 殘余檢測的方法學(xué)驗證，實現(xiàn)了對工程化酵母表達(dá)單克隆抗體原液中DNA 殘余量的高效、穩(wěn)定、高靈敏度的快速定量檢測，為工程化酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組生物制品的質(zhì)量控制提供了新的參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料

工程化酵母菌株制備的重組單克隆抗體（本研究室制備）；全自動熒光定量PCR 系統(tǒng)CFX Connect Real-Time System（美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）；TB Green Premix Dimer Eraser（Perfect Real Time）、PCR 管（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）；酵母基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生物技術(shù)有限公司）；5S rRNA 基因特異性引物1（5′-GGTTGCGGCCATATCTAG-3′）和P2（5′-AGATTGCAGCACCTGAGT-3）（上海生工生物有限公司）[10-11]；NANODROP 2000 分光光度計（Thermo Fisher Scientific）。

1.2 工程菌株基因組DNA 的提取

用酵母基因組DNA 提取試劑盒提取得到工程化菌株基因組DNA，用NANODROP 2000 測定基因組DNA 濃度及D260nm/D280nm值。

1.3 實時熒光定量PCR

將提取的工程化菌株的基因組DNA 用樣品緩沖液稀釋至不同濃度（1000、100、10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4pg/μL）作為標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度設(shè)置3 個平行樣品。反應(yīng)體系包括TB Green Premix（2×）12.5 μL、引物（10 μmol/L）各0.75 μL、DNA 模板10 μL、無菌ddH2O 9.0 μL，共25.0 μL（dNTP、DNA 聚合酶、緩沖液等PCR 體系包含在商業(yè)化TB Green Premix 中）。按照商業(yè)化TB Green Premix 說明書推薦的三步法進(jìn)行了部分優(yōu)化后的反應(yīng)條件為：95℃模板預(yù)變性30 s，95℃變性5 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，循環(huán)70 次，65℃升至95℃時系統(tǒng)收集熒光信號，獲得單峰熔解曲線。

1.4 待測樣品處理方法

將工程化酵母表達(dá)的單克隆抗體原液用注射用生理鹽水稀釋至4.0 mg/mL，設(shè)置3 個平行樣品。為了防止高蛋白濃度對PCR 結(jié)果的影響，在此基礎(chǔ)上再增加一組1/10 稀釋，即0.4 mg/mL，同樣設(shè)置3 個平行樣品。

1.5 精密度和回收率測定

將100、1、1×10-2pg/μL 的標(biāo)準(zhǔn)品和高低濃度組供試品設(shè)置8 個平行對照，計算標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品的精密度。

設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品1、1×10-1、1×10-2pg/μL 濃度與待測樣品混合進(jìn)行加樣回收實驗，設(shè)置3 個平行重復(fù)。用待測樣品稀釋1000 pg/μL 濃度的標(biāo)準(zhǔn)品分別至1、1×10-1、1×10-2pg/μL，采用下式計算回收率：回收率（%）=（標(biāo)準(zhǔn)品和樣品DNA 測定值-樣品測定值）/DNA 標(biāo)準(zhǔn)品理論值×100%

1.6 重組單克隆抗體原液中殘余DNA 含量測定

將測定的4.0 和0.4 mg/mL 單克隆抗體原液Ct 值（循環(huán)閾值）代入擬定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)回收率校正按下式計算DNA 殘余含量：樣品DNA 殘余量（pg/mg）=（樣品經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度值×1000）/待測樣品蛋白濃度。

按照單抗人用注射劑量為20 mg/次，計算每人用劑量中宿主DNA 殘余量。

2 結(jié)果

2.1 工程菌株基因組DNA 提取結(jié)果

用NANODROP 2000 測定提取的工程化菌株基因組DNA 濃度，超純水作為空白對照，測得DNA 濃度為8.2 ng/μL，D260nm/D280nm值為1.79，在1.7～1.9 范圍內(nèi)（純DNA 的D260nm/D280nm值為1.80）。

2.2 實時熒光定量PCR 檢測宿主DNA 殘余量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

標(biāo)準(zhǔn)品DNA 濃度為1×10-3～1×104pg/μL 時擴(kuò)增曲線光滑平穩(wěn)，峰值較高，3 個平行樣品的重復(fù)性較好，清晰區(qū)分了基線期、指數(shù)擴(kuò)增期、平臺期，呈現(xiàn)出“S”型曲線，DNA 擴(kuò)增效率高（圖1）。選取標(biāo)準(zhǔn)品DNA 濃度為1×10-3～1×103pg/μL 擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，以每個反應(yīng)管內(nèi)熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的拷貝數(shù)Ct 值為縱坐標(biāo)，樣品濃度取對數(shù)值為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.174，截距28.92，擴(kuò)增效率為1.22（圖2），樣品濃度x與循環(huán)閾值Ct 的線性關(guān)系表達(dá)式為Ct=-3.714x+28.92（x是DNA 標(biāo)準(zhǔn)品濃度取對數(shù)值）。圖3 為溫度從65℃升至95℃系統(tǒng)收集到的DNA 標(biāo)準(zhǔn)品的熔解曲線，可以看到所有標(biāo)準(zhǔn)品均呈現(xiàn)單一明顯的峰，無其他雜峰，說明反應(yīng)特異性良好，無非特異性擴(kuò)增和引物二聚體等干擾實驗結(jié)果。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品DNA 擴(kuò)增曲線

圖2 循環(huán)閾值Ct 與DNA 標(biāo)準(zhǔn)品濃度的關(guān)系曲線

2.3 精密度測定結(jié)果

如表1，DNA 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為100、1、1×10-2pg/μL 組的8 個平行樣品Ct 值的變異系數(shù)CV（%）分別為1.43、0.33、1.16，高、低濃度供試品8 個平行樣品Ct 值的變異系數(shù)CV（%）分別為2.86、2.62，說明該方法檢測的精密度高。

2.4 回收率測定結(jié)果

加樣回收率測定結(jié)果如表2，高濃度待測樣品組（4.0 mg/mL）的測定濃度與稀釋至1/10 后的低濃度待測樣品組的測定濃度相差不大，但加樣回收均偏差太大，說明高濃度蛋白的存在干擾了PCR 結(jié)果。低濃度待測樣品組的加樣回收率均為80%～120%。

圖3 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品的熔解曲線

2.5 待測樣品中DNA 殘余量測定結(jié)果

根據(jù)儀器檢測待測樣品的Ct 值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)加樣回收測定結(jié)果，用加樣回收率校正結(jié)果的準(zhǔn)確性。為避免高濃度蛋白對PCR 結(jié)果的影響，計算低濃度供試品（0.4 mg/mL）的宿主DNA 殘余量見表3，經(jīng)回收率校正后的平均值為0.049 pg/μL。如果按照單抗人用注射劑量為20 mg/次，換算成每劑量DNA 殘余量為2.45 ng，滿足藥典對于酵母系統(tǒng)產(chǎn)品宿主核酸殘余量不高于10 ng/劑量的要求。

3 討論

本研究團(tuán)隊用糖基工程酵母制備的重組單克隆抗體是國內(nèi)首次利用酵母系統(tǒng)制備重組單克隆抗體，急需建立相應(yīng)的質(zhì)控檢測方法學(xué)，推動中試和臨床前研究。

外源DNA 殘余量的測定多采用DNA 探針雜交法或熒光染色法[12-14]，這也是2015 版藥典中推薦的方法，但抗體制品用藥劑量大，人用劑量達(dá)到幾十甚至幾百毫克。由于存在高濃度蛋白的干擾[15]和實驗方法檢測限的限制，測定結(jié)果往往不太理想。實時熒光定量PCR 是在PCR 體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR 過程，最后通過特定數(shù)學(xué)原理對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。熒光信號的強(qiáng)弱與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，從而達(dá)到絕對定量的效果。相對于DNA 探針雜交法和熒光染色法，實時熒光定量PCR 法具有操作簡單、特異性好、自動化程度高等優(yōu)點。

表1 DNA標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品的精密度

表2 回收率測定結(jié)果

表3 低濃度待測樣品組的DNA殘余量

在這里我們優(yōu)化了引物設(shè)計、反應(yīng)體系、反應(yīng)條件、加樣回收實驗等，提高了PCR 反應(yīng)的特異性，基本克服了方法學(xué)缺陷。標(biāo)準(zhǔn)品DNA 濃度為1×10-3～1×103pg/μL 時具有良好的線性關(guān)系（R2＞0.99），滿足微量DNA 殘余的檢測需求。利用本法測得人用重組單克隆抗體（畢赤酵母）原液中宿主DNA 殘余量為2.45 ng/劑量，低于10 ng/劑量的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。優(yōu)化后的加樣回收實驗，DNA 標(biāo)準(zhǔn)品回收率控制在80%～120%，方法精密度良好，RSD 值≤5%。該方法檢測限達(dá)到1×10-3pg/μL，是一種靈敏度高、穩(wěn)定性好、簡便快速的檢測生物制品（畢赤酵母）中宿主DNA 殘余量的方法，適用于新藥研發(fā)的質(zhì)量控制研究，具有較好的應(yīng)用范圍和前景。