朱會(huì)霞，孫金旭，孫 浩

(衡水學(xué)院，河北 衡水 053000)

覆盆子(Raspberry)又名大號(hào)角公，覆盆子果實(shí)中糖的含量大約為2.40%～10.67%，有機(jī)酸的含量大約為0.62%～4.09%，同時(shí)還含有維生素B族，維生素C，煙酸及17種人體必需氨基酸[1-2]。

單糖本身不會(huì)吸收紫外光，這是采用HPLC分析單糖組成時(shí)遇到的最大難點(diǎn)，所以只有使它在紫外區(qū)具有吸收才能進(jìn)行分析，這就需要對單糖進(jìn)行衍生化，但衍生化所使用的試劑的選擇和色譜分析的條件都是很困難的。所以，利用衍生化HPLC測定單糖這個(gè)方法到現(xiàn)在還在不斷的研究和完善中[3-4]。本實(shí)驗(yàn)主要運(yùn)用示差折光檢測器來操作，然后把分離度和峰型作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，選取色譜柱、流動(dòng)相的組成等色譜條件，最后確定適用單糖HPLC分析的色譜條件。建立了適合覆盆子多糖中單糖組成測定的HPLC新方法。這種方法不需要進(jìn)行糖的衍生化步驟，也不需要減少單糖測定的處理環(huán)節(jié)，而且可以準(zhǔn)確迅速地達(dá)到目標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

覆盆子(購于衡水市中醫(yī)院藥店)。

1.2 儀器與試劑

HPLC(Agilent 1100大連三杰科技發(fā)展有限公司)配紫外檢測器；組織搗碎機(jī) XA-1(金壇市開發(fā)區(qū)吉特實(shí)驗(yàn)儀器廠)；分光光度計(jì) UV-250(日本島津) 色譜柱：C18柱(安捷倫C18標(biāo)準(zhǔn)柱)。

葡萄糖(Glc)；半乳糖(Gal)；果糖(Flu)；甘露糖(Man)；鼠李糖(Rha)；阿拉伯糖(Ara)；PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)，其它試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 覆盆子多糖的提取

圖1 覆盆子多糖提取工藝流程

1.3.2 覆盆子多糖的水解

稱取一定量的經(jīng)1.3.1提取的覆盆子多糖，加入TFA溶液2 mL(濃度2 mol/L)，封口，搖勻，100℃下，水解6 h，冷卻至室溫后，經(jīng)1000 r/min離心5 min后，取上清液，NaOH中和至中性，真空凍干后備用。

1.3.3 PMP衍生化產(chǎn)物的制備方法

1.3.3.1 單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合物的衍生物制備

稱取一定量的單糖標(biāo)準(zhǔn)品，分別配置成0.2 mol/L的單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，取80 μL的單糖標(biāo)準(zhǔn)品放于同一試管中，混勻后，分別加入100 μL 濃度為0.3 mol/L的NaOH和1.2 mL濃度為0.5 mol/L的PMP的甲醇溶液，搖勻，在70℃的水浴環(huán)境中反應(yīng)40 min后冷卻至室溫，加入稀鹽酸中和至中性，用CHCl3萃取5次，水相為PMP衍生物。

1.3.3.2 覆盆子多糖水解產(chǎn)物PMP衍生物的制備

將經(jīng)1.3.2處理后的覆盆子多糖水解產(chǎn)物按1.3.3.1的方法進(jìn)行處理后即為覆盆子多糖水解產(chǎn)物PMP衍生物。

1.3.4 單糖標(biāo)品及覆盆子多糖HPLC測定條件

流動(dòng)相：100 mmol/L醋酸胺緩沖溶液(pH值5.5)/乙腈(體積比為78∶22)，等度洗脫，流速1 mL/min；紫外檢測波長：245 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：室溫。

1.3.5 單糖定量計(jì)算[5]

1.3.5.1 校正因子fi/s

式中：fi/s校正因子；

mi標(biāo)準(zhǔn)混合液中單糖量(mol)；

ms內(nèi)標(biāo)單糖的量(mol)；

Ai標(biāo)準(zhǔn)混合液中單糖峰面積；

As內(nèi)標(biāo)單糖峰面積。

1.3.5.2 摩爾比例計(jì)算

式中：Ri/s摩爾比例；

fi/s校正因子；

Ai標(biāo)準(zhǔn)混合液中單糖峰面積；

As內(nèi)標(biāo)單糖峰面積；

M單糖分子量。

1.3.6 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算

相對標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算公式如(3)、(4)、(5)所示：

1.3.7 回收率計(jì)算

回收率計(jì)算公式如下：

式中：(A:回收率；W：原覆盆子多糖中各單糖含量，μmol；Z：加標(biāo)量，μmol；E：加標(biāo)后測定混合液中各單糖含量，μmol)

2 結(jié)果與討論

2.1 單糖標(biāo)品HPLC色譜圖

在設(shè)定的HPLC條件下，進(jìn)樣混合單糖標(biāo)品，在流動(dòng)相流速分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min的條件下分別進(jìn)行進(jìn)樣，已達(dá)到良好分離效果的目的，結(jié)果如圖2、3所示。

圖2 混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品PMP水解衍生色譜圖

圖3 覆盆子多糖水解衍生色譜分析圖

如圖2所示，經(jīng)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在流動(dòng)相流速為1.5 mL/min條件下，單糖混合標(biāo)樣能夠達(dá)到較好的分離效果，各個(gè)單糖標(biāo)樣出峰效果較好，因此確定流動(dòng)相流速1.5 mL/min為適宜。

2.2 方法性能分析

2.2.1 單糖標(biāo)準(zhǔn)品曲線方程

分別吸取各單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)衍生處理后，進(jìn)行梯度稀釋，HPLC測定，以響應(yīng)的單糖濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的HPLC峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算各個(gè)單糖標(biāo)準(zhǔn)品的曲線方程，結(jié)果如表1所示。

表1 單糖標(biāo)品曲線方程

由表1可知，各單糖標(biāo)品峰面積與單糖濃度之間均呈良好的線性關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)均在99%以上。

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

將各個(gè)單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液分裝于5個(gè)樣品瓶中，經(jīng)衍生化處理后，HPLC色譜測定5次，計(jì)算峰面積，根據(jù)公式(3)、(4)、(5)(6)計(jì)算得出RSD值，結(jié)果如表2所示。

表2 單糖標(biāo)品精密度實(shí)驗(yàn)表

由表2可知，各單糖經(jīng)5次測定峰面積計(jì)算出各單糖標(biāo)品的RSD值分別為：Glc0.45%；Gal 0.86%；Flu 0.70%；Man1.19%；Rha0.76%；Ara0.84%，表明此HPLC條件精密度良好，設(shè)計(jì)合理，較為適宜于測定覆盆子多糖中各單糖含量。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

分別提取覆盆子多糖樣品5份，經(jīng)水解衍生處理后，高效液相色譜測定樣品中各個(gè)單糖含量，測定后分別計(jì)算各單糖的RSD值，結(jié)果如表3所示。

表3 覆盆子多糖各單糖組成重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

由表3可知，經(jīng)水解衍生后，覆盆子各單糖成分經(jīng)5次HPLC測定，結(jié)果各單糖的RSD值分別為Glc0.95%；Gal 0.79%；Flu 0.55%；Man0.79%；Rha0.19%；Ara0.68%，表明該HPLC試驗(yàn)條件重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取經(jīng)處理好的覆盆子多糖溶液一份，分別在0、4、8、12、16 h時(shí)分別進(jìn)樣測定分析，結(jié)果如表4所示。

表4 覆盆子多糖各單糖組成穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

如表4可知，經(jīng)處理后的覆盆子多糖在不同時(shí)間點(diǎn)測定各單糖含量，并計(jì)算RSD值，分別為Glc0.76%；Gal 0.27%；Flu 0.91%；Man0.73%；Rha0.30%；Ara0.11%，表明該HPLC法測定覆盆子多糖中的各單糖含量在16 h穩(wěn)定。

2.2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

表5 覆盆子單糖回收率實(shí)驗(yàn)

取覆盆子多糖液一份，經(jīng)處理后，測定覆盆子多糖中的各單糖物質(zhì)含量，分別加入一定濃度各單糖標(biāo)品，經(jīng)衍生處理后，測定加標(biāo)后各單糖含量，計(jì)算回收率，結(jié)果如表5所示。

由圖5可知，經(jīng)加標(biāo)后，各單糖標(biāo)品的回收率在96.16%～102.67%之間，表明標(biāo)品回收良好，此方法適宜于覆盆子多糖中各單糖含量的測定。

2.3 覆盆子多糖衍生物分析

取一定量覆盆子多糖樣品，經(jīng)水解衍生處理后，HPLC法測定各單糖組成及含量，結(jié)果如圖2及表6所示。

3 結(jié)論

經(jīng)分離后的覆盆子粗多糖采用柱前水解衍生處理，利用HPLC法對覆盆子多糖中的單糖組成及含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明，HPLC條件分離分析覆盆子多糖中單糖含量及組成實(shí)驗(yàn)精密度良好，實(shí)驗(yàn)條件重復(fù)性良好且較穩(wěn)定，覆盆子多糖中含有葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖等六種單糖，且其物質(zhì)的量比例為0.05∶1.37∶0.20∶0.10∶1.00∶1.95。