蘇凌浩 ，裴世深，應(yīng)金威，徐成，文天佑，阮狄克

(1南方醫(yī)科大學(xué)，廣州510000；2中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心)

臨床上對(duì)于由腰椎間盤退變而導(dǎo)致的下腰痛主要采取保守治療和手術(shù)為主的綜合治療兩種方法。然而，保守治療只能緩解癥狀，并不能阻礙疾病的進(jìn)一步發(fā)展；手術(shù)為主的綜合治療往往是患者最終的結(jié)局[1]，但是術(shù)后易出現(xiàn)并發(fā)癥以及相鄰節(jié)段的病變[2]。因此，尋求介于保守治療和手術(shù)治療之間的治療方案，以期在椎間盤退變初期修復(fù)椎間盤，甚至逆轉(zhuǎn)椎間盤退變形式成為新的研究熱點(diǎn)。研究顯示，生長(zhǎng)因子在維持椎間盤內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起重大作用。如BMP-7、BMP-2、TGF-β等能增加椎間盤內(nèi)水含量，并促進(jìn)Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成[3]。BMP-7在修復(fù)椎間盤損傷的過程中，不但能夠促進(jìn)Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達(dá)，還具有使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)向受損部位趨化遷移、促使BMSCs向軟骨細(xì)胞分化和抑制髓核細(xì)胞凋亡的作用，因此非常有希望成為延緩椎間盤退變的種子因子。但與此同時(shí)，生長(zhǎng)因子進(jìn)入椎間盤后很快會(huì)被椎間盤自身內(nèi)環(huán)境所代謝，存在時(shí)間較短，不能持續(xù)發(fā)揮其有效作用，往往需要多次注射。另一方面，BMP-7具有很強(qiáng)的成骨作用，直接注射到椎間盤體內(nèi)，會(huì)造成一定的成骨風(fēng)險(xiǎn)[4]。本課題組前期將BMP-7的3個(gè)活性片段SNVI、KPSS和KAIS通過化學(xué)鍵方式結(jié)合在新型自組裝納米纖維支架材料RADA16-Ⅰ的C端，形成了3種不同的功能化自組裝多肽。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)載有KPSS片段的RADKPS對(duì)人類退變的髓核細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)最強(qiáng)，且作用持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，同時(shí)成骨能力最弱。為此，本研究制作椎間盤退變模型，對(duì)RADKPS水凝膠在活體內(nèi)對(duì)椎間盤的修復(fù)作用進(jìn)行了觀察。

1 材料與方法

1.1 主要材料 1歲齡健康的雜種犬16只(10～15 kg)，雌雄不限，由北京軍事醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。本研究獲得中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。RADA16-Ⅰ、RADKPS多肽粉末各 100 mg(利用固相合成法合成，純度>90%，上海生工生物工程股份有限公司)；胎牛血清(Gibco，美國)；LG-DMEM 培養(yǎng)基(Solarbio，中國)； PBS 緩沖液(Hyclone，美國)；番紅O染色(碧云天生物技術(shù)公司)；HE染液(北京索寶生物科技有限公司)；胰酶(Gibco，美國)；聚集蛋白多糖/Ⅱ型膠原ELISA 檢測(cè)試劑盒(Blue Gene，中國)；培養(yǎng)瓶(Corning，美國)抗犬聚集蛋白多糖/Ⅱ型膠原一抗(ABCAM，英國)；蛋白定量試劑盒(Thermo公司，美國)。

1.2 犬椎間盤退變模型制作及分組治療干預(yù) 16只雜交犬，每只選取L3～4、L4～5、L5～6、L6～7椎間盤進(jìn)行核磁共振檢測(cè)，確保造模前每個(gè)腰椎間盤均未退變，均一性良好，參照文獻(xiàn)穿刺制作椎間盤退變模型[5]。待椎間盤造模4周后，通過MRI檢查測(cè)定椎間盤髓核區(qū)域以及相對(duì)部位腦脊液的灰度值，計(jì)算相對(duì)灰度值指數(shù)(RGI)，確認(rèn)造模后椎間盤RGI較造模前明顯下降，且均一良好，保證造模后L3～4、L4～5、L5～6、L6～7椎間盤之間RGI比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然后，分別用4支不同的微量注射器(27 g)裝載不同的藥物注射椎間盤進(jìn)行干預(yù)治療。L3～4注射不含活性片段的RADA16-I水凝膠40 μL(RADA16-Ⅰ組)，L4～5注射PBS緩沖液40 μL(PBS組)，L5～6注射功能化自組裝多肽RADKPS水凝膠40 μL(RADKPS組)，L6～7注射BMP-7 40 μL(BMP-7組)，L7～S1不做任何處理(正常對(duì)照組)。

1.3 椎間盤影像學(xué)觀察 在造模前、造模4周、治療12周進(jìn)行X線檢查，并通過公式算出椎間盤相對(duì)高度指數(shù)(DHI%)。DHI=2×(B1+B2+B3)/[(A1+A2+A3)+(C1+C2+C3)]。A1:上位椎體前緣高度；A2:上位椎體中央高度；A3:上位椎體后緣高度；B1:椎間盤前緣高度；B2:椎間盤中央高度；B3:椎間盤后緣高度；C1:下位椎體前緣高度C2；下位椎體中央高度；C3下位椎體后緣高度。DHI%=術(shù)后椎間盤DHI/術(shù)前椎間盤DHI。在造模前、造模4周及干預(yù)治療4、8、12周5個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行MRI檢查，掃描采用 Turbo RARE T2WI序列，掃描主要參數(shù):FOV 60 mm×40 mm, TR/TE4 200 ms/36 ms,層厚1.0 mm,層間距0.5 mm,FA 180°,Matrix 256 ×256,空間最小分辨。MRI成像水平掃描架內(nèi)徑16 cm,使用心臟線圈率為 234 μm×156 μm/像素，通過影像工作站的Manager軟件測(cè)定椎間盤髓核區(qū)域以及相對(duì)部位腦脊液的灰度值，計(jì)算其RGI。

1.4 椎間盤組織學(xué)檢查 在干預(yù)治療12周，犬安樂死取出中心的髓核組織。用甲醛固定1周后給予石蠟包埋、切片，分別進(jìn)行HE染色、Ⅱ型膠原和蛋白多糖免疫組化染色。利用計(jì)算機(jī)Image plus軟件計(jì)算出圖片的累計(jì)光密度值，除以染色區(qū)域面積，計(jì)算Ⅱ型膠原和蛋白多糖平均光密度值(AOD)。

1.5 椎間盤生化成分定量分析 干預(yù)治療12周取出中心的髓核組織，EP管封存后，轉(zhuǎn)存于-40 ℃冰箱備用，其過程均在無菌狀態(tài)下操作。通過ELISA定量檢測(cè)蛋白多糖和Ⅱ型膠原水平。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況 16只動(dòng)物中，1只動(dòng)物在術(shù)中因?yàn)槁樽磉^量而死亡，1只術(shù)后出現(xiàn)坐骨神經(jīng)損傷的表現(xiàn)，但術(shù)后2月運(yùn)動(dòng)肌力恢復(fù)正常；其余實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未發(fā)生明顯手術(shù)并發(fā)癥，術(shù)后活動(dòng)正常。死亡動(dòng)物有樣本補(bǔ)充。

2.2 各組X線檢查椎間盤DHI%變化 與本組造模前比較，治療12周BMP-7組、RADA16-Ⅰ組和PBS組椎間盤DHI%均降低(P均<0.05)，RADKPS組椎間盤DHI%無變化(P>0.05)。相同時(shí)間點(diǎn)比較，椎間盤DHI%正常對(duì)照組、RADKPS組、BMP-7組、RADA16-Ⅰ組、PBS組依次降低，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)椎間盤DHI%變化

2.3 各組MRI檢查椎間盤RGI變化 正常對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)RGI比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。治療4、8、12 周3個(gè)時(shí)間點(diǎn)RGI比較，RADKPS組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)，BMP-7組、RADA16-Ⅰ組、PBS組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。治療8 、12 周，組間兩兩比較，RGI差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)MRI檢查椎間盤RGI變化

2.4 各組椎間盤組織HE染色情況 正常對(duì)照組髓核組織HE染色均一深度紅染，含有大量團(tuán)簇樣細(xì)胞，分布均勻；RADKPS組髓核組織染色較為均一，可見少量團(tuán)簇樣細(xì)胞；BMP-7組、RADA16-Ⅰ組髓核組織團(tuán)簇樣細(xì)胞消失，髓核組織結(jié)構(gòu)紊亂；PBS組髓核組織細(xì)胞數(shù)量明顯減少，組織逐漸被膠原所取代。

2.5 各組椎間盤Ⅱ型膠原染色情況 BMP-7組和RADA-16組Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)均較RADAKPS組明顯降低，每高倍視野陽性細(xì)胞平均數(shù)明顯降低，棕色陽性染色細(xì)胞數(shù)明顯減少。正常對(duì)照組、RADKPS組、BMP-7組、RADA16-Ⅰ組、PBS組Ⅱ型膠原AOD值分別為0.800±0.023、0.653±0.032、0.252±0.023、0.233± 0.013、0.171±0.001，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.6 各組椎間盤蛋白多糖染色情況 BMP-7組和RADA16-Ⅰ組蛋白多糖表達(dá)為弱陽性，RADAKPS組與正常對(duì)照組陽性染色明顯。正常對(duì)照組、RADKPS組、BMP-7組、RADA16-Ⅰ組、PBS組蛋白多糖AOD值分別為0.860±0.012、0.742±0.014、0.343±0.018、0.321±0.023、0.214±0.016，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.7 各組椎間盤蛋白多糖和Ⅱ型膠原水平比較 治療12 周，各組椎間盤蛋白多糖、Ⅱ型膠原水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表3。

表3 治療12 周各組Ⅱ型膠原、蛋白多糖水平比較

3 討論

既往研究中，BMP-7之所以能夠?qū)ψ甸g盤損傷產(chǎn)生很好的修復(fù)效果取決于其搭載3個(gè)活性片段SNVI、KPSS和KAIS。研究發(fā)現(xiàn)，KPSS的修復(fù)能力最強(qiáng)，同時(shí)成骨能力最弱。因此，KPSS活性短肽可望成為修復(fù)椎間盤退變的主要生物因子之一。BMP-7的3個(gè)活性片段SNVI、KPSS和KAIS通過化學(xué)鍵方式結(jié)合在RADA16-Ⅰ的C端，可形成3種不同的功能化自組裝多肽。體外研究發(fā)現(xiàn)，載有KPSS片段的RADKPS對(duì)人類退變的髓核細(xì)胞的生物學(xué)作用最強(qiáng)，且作用持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)[6]。Li等[7]發(fā)現(xiàn),功能化自組多肽水凝膠RADKPS對(duì)凋亡誘導(dǎo)環(huán)境中髓核干細(xì)胞具有保護(hù)作用，提示其有作為退變椎間盤組織工程材料的潛能。Wu等[8]證實(shí)，RADKPS水凝膠既具有BMP-7促進(jìn)Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達(dá)的作用，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs向受損部位趨化遷移，并向軟骨細(xì)胞分化，還能夠持久在椎間盤內(nèi)表達(dá)，減緩BMP-7的成骨風(fēng)險(xiǎn)。既往研究證實(shí),修飾有BMP-7 功能片段的新型功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠RADKPS具有良好的細(xì)胞相容性、血液相容性及組織相容性[9]。此外RADA16-Ⅰ自身具有很強(qiáng)的機(jī)械特性，能夠恢復(fù)椎間盤高度，且能夠通過提高椎間盤內(nèi)水含量從而促進(jìn)椎間盤的修復(fù)。因此,RADKPS水凝膠有望成為椎間盤修復(fù)構(gòu)建組織工程髓核的理想材料之一。

犬椎間盤與人椎間盤形態(tài)上較為相似，大小適中，適合觀察，且犬的脊索細(xì)胞自幼年期開始就逐漸減少，適宜作為研究對(duì)象。纖維環(huán)穿刺負(fù)壓抽吸制作椎間盤退變模型，重復(fù)性良好，通過控制不同節(jié)段的負(fù)壓強(qiáng)度及持續(xù)時(shí)間可以控制椎間盤損傷層度從而制造退變均一的模型。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究中，沒有癥狀的椎間盤退變主要靠影像學(xué)檢查來判斷。早期影像學(xué)主要表現(xiàn)為MRI檢查中T2相上髓核組織灰度值減低，退變髓核呈現(xiàn)黑色信號(hào)改變；隨著退變的加重，后期X線平片出現(xiàn)椎間盤高度的下降。本研究采取髓核相對(duì)灰度值判斷椎間盤影像上信號(hào)的變化，比起單純依靠肉眼觀察的Pfirrmann分級(jí)定性標(biāo)準(zhǔn)能夠更加準(zhǔn)確量化退變的嚴(yán)重程度。在本研究中，RADKPS水凝膠組術(shù)后椎間盤高度和灰度均得到有效保持，表明髓核含水量得到有效維持，延緩了椎間盤退變進(jìn)展。治療前后DHI%對(duì)比也驗(yàn)證了RAKPSS水凝膠組椎間盤高度要比造模后其他組保持更良好的狀態(tài)。另一方面，組織學(xué)檢測(cè)可以從微觀角度評(píng)估椎間盤細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的變化。髓核組織切片HE染色結(jié)果表明，RADKPS水凝膠延緩了髓核細(xì)胞丟失的速度，較好地保持了髓核組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞外基質(zhì)。椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)主要包括蛋白多糖和Ⅱ型膠原，椎間盤退變時(shí)蛋白多糖、Ⅱ型膠原含量降低。本研究免疫組化染色結(jié)果顯示，RADKPS組蛋白多糖、Ⅱ型膠原表達(dá)深染區(qū)域明顯多于對(duì)照組，ELISA定量分析顯示RAKPSS組蛋白多糖、Ⅱ型膠原含量也得到了有效保留。

本研究還存在一些不足之處，如X線的拍攝時(shí)間未能做到和MRI同步、未做到大樣本分時(shí)間段多次取標(biāo)本進(jìn)行生化定量分析、未進(jìn)行單個(gè)運(yùn)動(dòng)節(jié)段的生物力學(xué)分析、觀察時(shí)間短等。因此，RAKPSS水凝膠延緩椎間盤退變的作用尚需要進(jìn)一步研究。